ARB類藥物對2K1C型腎血管性高血壓大鼠左室重構(gòu)方面的類效應(yīng)及作用研究

，，，

目前高血壓的治療，仍以藥物治療為主，非藥物治療為輔[1]。高血壓的藥物治療主要有利尿劑、β腎上腺素能受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑(CCB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體阻滯劑(ARB)[2]。諸多藥物中，臨床醫(yī)生面臨著藥物的選擇問題。自1994 年第一個ARB氯沙坦應(yīng)用于臨床以來，對ARB 的認識也不斷提升，ARB 類降壓藥是一種長效、平穩(wěn)、強效的降壓藥，通過選擇性阻斷AngⅡ與AngⅡ1型受體(AT1R)結(jié)合發(fā)揮其降壓及保護靶器官的作用，在逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)方面有著積極的作用[3-5]，在心血管疾病的治療中得到越來越多臨床醫(yī)生的重視。本實驗使用4種ARB 類藥物(氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦、厄貝沙坦)對實驗性腎血管性高血壓大鼠進行干預(yù)，從整體、器官、細胞和分子水平4個層面來對比研究不同ARB類藥物對腎血管性高血壓大鼠心肌的保護作用，了解ARB 類藥物在改善左室重構(gòu)方面有無類效應(yīng)，并初步探討核因子-κB(NF-κB)的表達在高血壓左室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 氯沙坦，杭州默沙東制藥有限公司(50 mg)；替米沙坦，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司(80 mg)；厄貝沙坦，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司(150 mg)；纈沙坦，北京諾華制藥有限公司(80 mg)；NF-κB兔單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；膠原Ⅰ、膠原Ⅲ單克隆抗體，武漢博士德生物工程公司；SP試劑盒，武漢博士德生物工程公司；DAB 顯色試劑，武漢博士德生物工程公司；4%多聚甲醛，我院配制。

1.1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠56只，體重261 g±12 g，由我院動物實驗中心提供。將動物分別放置在16個籠子，每個籠子放4只大鼠，并將其放在標(biāo)準(zhǔn)的實驗房進行喂養(yǎng)，溫度保持在22 ℃，與此同時給予一定的光照，并進行常規(guī)的喂養(yǎng)，飲水自由。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 建立高血壓動物模型并進行分組處理。56只大鼠隨機分為空白對照組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)及模型組(n=40)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組采用改良的二腎一夾(2K1C)的方法建造腎血管性高血壓大鼠模型，模型建立成功后，隨機分為4個治療組(n=8)及1個模型對照(手術(shù))組(n=8)。

1.2.2 模型建立方法 模型以改良的二腎一夾方法建立。4個治療組及模型對照組給予1%的戊巴比妥鈉，然后根據(jù)40 mg/kg的含量向大鼠腹腔內(nèi)部注射進行麻醉處理，等動物完全麻醉以后，即肌肉的張力以及角膜反射等全部消失為止，讓大鼠處于仰臥位，固定到手術(shù)臺上。將其腹部皮膚的毛全部剪掉，并使用碘伏進行消毒、鋪巾處理，然后在腹部正中左側(cè)做一個切口，離劍突1 cm左右，切口長度4 cm，將腹腔打開，分離臟器，找到腹主動脈以及腹主靜脈的位置，在腎動脈的分支部位使用玻璃分針將腎動脈分離出來，使用4號針頭進行穿線結(jié)扎，引起腎動脈部位狹窄。經(jīng)過消毒處理以后，每只肌肉注射青霉素4×104U，持續(xù)用藥1周。手術(shù)完成后，動物置保溫箱中進行加熱處理，蘇醒過后放到普通籠子中，禁食禁水1 d。動物恢復(fù)正常排尿以后，才可以正常飲食飲水。假手術(shù)組給予1%的戊巴比妥鈉按照40 mg/kg麻醉大鼠，待動物麻醉完全后在無菌條件下給予手術(shù)，只剝離腎動脈，不結(jié)扎，術(shù)后給予青霉素4×104U腹腔注射，待動物清醒后，稍微加熱些許時間，然后單獨放置，禁水禁食24 h，進行觀察。手術(shù)后4周，每周測量清醒狀態(tài)下大鼠動脈收縮壓，如果其收縮壓高于術(shù)前30mmHg(1mmHg=0.133 kPa)，并且大于150 mmHg認為造模成功。

1.2.3 干預(yù)方法 建模后大鼠藥物干預(yù)方法：各治療組按照藥品說明書推薦的臨床使用劑量分別給予氯沙坦(30 mg/kg)、纈沙坦(30 mg/kg)、替米沙坦(30 mg/kg)、厄貝沙坦(50 mg/kg)灌胃；對假手術(shù)組、空白對照組以及模型對照組進行生理鹽水灌胃處理，每日1次。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組大鼠心肌組織病理及結(jié)構(gòu)變化，觀察血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)及NF-κB、Ⅰ型膠原和Ⅲ 型膠原的表達。①每周測量1次清醒安靜狀態(tài)下大鼠尾動脈收縮壓。②測定左心室指數(shù)及心臟指數(shù)：給藥8周后，術(shù)前禁食12 h，每只大鼠稱取體重(BW)后，采用1%的戊巴比妥鈉按照40 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射麻醉，解剖后迅速取出心臟，投入4 ℃冰磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，使離體心臟收縮3個或4個心動周期，射出左心室內(nèi)殘余血液，稱心臟的重量(HW)，然后沿房室交界處去除左右心房及大血管，去除右心室游離壁，吸水紙吸干殘余水分，將左心室進行稱重(LVW)，HW/BW表示心臟指數(shù)，LVW/BW表示左心室指數(shù)。③選取一部分左心室心肌，通過濃度為4%的多聚甲醛進行固定處理，部分心肌組織-70 ℃低溫冰箱保存，使用常規(guī)的HE法染色處理，在光鏡下觀察心肌細胞以及間質(zhì)的變化。④采用SP免疫組化法檢測心肌組織中NF-κB、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的表達。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理及結(jié)構(gòu)變化 空白對照組：心肌纖維走行沒有異常并且排列非常整齊，心肌細胞的細胞核為圓形，位于細胞的正中央位置，心肌的間質(zhì)以及微血管等結(jié)構(gòu)都基本正常。假手術(shù)組：心肌排列緊密，纖維組織無增生，血管內(nèi)皮完好，心肌細胞核呈圓形或橢圓形，居細胞中央。模型對照組：心肌纖維組織增生，心肌扭曲斷裂、纖細，細胞萎縮、水腫，心肌細胞灶樣壞死，部分心肌纖維消失，淋巴細胞等炎性細胞浸潤，纖維細胞增生，黏液樣變性，心肌毛細血管增多，管腔狹窄，管壁增厚。氯沙坦組：心肌間質(zhì)纖維增生，肌纖維排列較緊密，心肌組織部分斷裂，心肌纖維變細，血管外可見外膜增生，心肌纖細，少量淋巴細胞浸潤。替米沙坦組：可見肌纖維斷裂，血管外滲出，小灶樣纖維壞死，血管外可見纖維點狀增生，內(nèi)膜下纖維增生，少量淋巴細胞。纈沙坦組：心肌細胞水腫明顯，少量纖維細胞增生，血管內(nèi)膜增生，組織充血，肌纖維排列較稀疏，少量纖維組織變性。厄貝沙坦組：心肌組織充血水腫，血管周圍少量纖維化，淋巴細胞浸潤，內(nèi)膜下纖維組織增生，蛋白沉積和肌纖維斷裂，排列不齊，心肌組織可見點狀缺血壞死，纖維組織增生。詳見圖1。

圖1 心肌組織HE 染色(×200)

2.2 各組大鼠血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)比較 模型對照組與空白對照組比較，心臟指數(shù)及左心室指數(shù)均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示左心室負荷加重。假手術(shù)組與空白對照組比較，血壓、心臟指數(shù)及左心室指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組與模型對照組比較，血壓、心臟指數(shù)及心室指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明大鼠血壓升高是大鼠腎動脈部分狹窄所致。各治療組與模型對照組比較，用藥8周血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用藥8 周后，厄貝沙坦組較其他組血壓下降明顯，降壓效果最好(P<0.05)；氯沙坦組用藥后血壓高于其他3組，降壓效果稍差(P<0.05)；氯沙坦組心臟指數(shù)、左心室指數(shù)高于厄貝沙坦、替米沙坦、纈沙坦組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血壓、心臟指數(shù)及左心室指數(shù)比較(±s)

2.3 各組大鼠 NF-κB、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的比較 模型對照組與空白對照組比較，實驗結(jié)束時NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組與空白對照組比較，NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組與模型對照組比較，NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。厄貝沙坦組、纈紗坦組、替米沙坦組、氯沙坦組與模型對照組比較，NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4個治療組用藥8 周后組間比較：氯沙坦組NF-κB的表達高于厄貝沙坦組、替米沙坦組以及纈沙坦組(P<0.05)，而厄貝沙坦組、替米沙坦組、纈沙坦組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達各用藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組NF-κB、Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達比較(±s) ng/mL

3 討 論

近年來的研究證明，心室重構(gòu)與高血壓病的預(yù)后密切相關(guān)，而左室肥厚為左室重構(gòu)的一種表現(xiàn)形式，是一個獨立的危險因素[6]。在諸多高血壓治療藥物中，降壓本身的效果都可以改善由高血壓引起的左室負荷過重，進而阻止左室重構(gòu)的發(fā)展。ARB類藥物在降壓的同時，其自身的藥物作用機制本身也可對左室重構(gòu)起到保護作用。對于高血壓發(fā)病以及靶器官受損的病人來說，腎素血管緊張素系統(tǒng)具有非常重要的作用。AngⅡ?qū)儆谠撓到y(tǒng)中一個非常重要的效應(yīng)因子[7]。AngⅡ1 型受體屬于作用于靶細胞的公共通路，主要是用來進行腎素-血管緊張素系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)。血管緊張素的血流動力學(xué)以及非血流動力學(xué)作用有很多，如影響水電解質(zhì)平衡、提高血壓以及對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響等，這些均被證實為AngⅡ1型受體被AngⅡ激活后的主要效應(yīng)[8]。AngⅡ1型受體能夠?qū)ψ笮氖业闹貥?gòu)產(chǎn)生很多作用，如能夠造成左心室的心肌細胞肥大并且出現(xiàn)間質(zhì)重塑的現(xiàn)象。根據(jù)相關(guān)報道，不管是在體內(nèi)還是體外進行細胞培養(yǎng)，血管緊張素都能夠造成小鼠以及成年大鼠或者人的心肌間質(zhì)出現(xiàn)纖維細胞增殖，并且還會產(chǎn)生大量的膠原蛋白，甚至可以使膠原蛋白的成分發(fā)生變化，尤其是增加Ⅰ型膠原蛋白[9]。除此之外，還能夠?qū)δz原蛋白的降解產(chǎn)生一定的抑制作用，最終會造成左心室出現(xiàn)僵硬以及舒張功能下降的現(xiàn)象[10]。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠心臟指數(shù)增高，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白的表達也明顯增高，說明存在左室負荷加重，有左室重構(gòu)發(fā)生的跡象。治療組大鼠經(jīng)ARB類藥物干預(yù)后，心臟指數(shù)、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白的表達較模型對照組均明顯減少。表明4種ARB類藥物對高血壓大鼠左室重構(gòu)均有不同程度的改善。

近年來的研究認為NF-κB在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的作用，故推測其可能在高血壓病理過程中亦起重要作用[11]。對于很多的炎性細胞因子來說，NF-κB是其共同的通路，在介導(dǎo)各種炎性因子合成的過程中發(fā)揮著非常重要的作用[12]。其與炎癥細胞因子的相互作用有：NF-κB活化后，可增強腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-1(IL-1)等炎性細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，使TNF-α、IL-1、IL-3產(chǎn)生和釋放增多，同樣，炎性細胞因子也能反過來激活NF-κB的活性，進而使得TNF-α和白細胞介素-1β(IL-1β)再次激活NF-κB；NF-κB活化后還可使白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)產(chǎn)生和釋放增多，導(dǎo)致最初的炎癥信號進一步放大。如果血管緊張素和其他受體相結(jié)合，就會引起循環(huán)中NF-κB被迅速地激活，并且能夠?qū)F-κB產(chǎn)生一定的刺激，使其表達增加，最終造成炎性因子的表達升高，如IL-6、TNF-α等[13]。ARB類藥阻斷了AngⅡ與受體結(jié)合，進而阻斷了其引起的炎癥細胞因子的表達增加，同時抑制其收縮血管與刺激腎上腺素釋放醛固酮作用的機制，達到控制血壓、保護心血管系統(tǒng)的作用。本研究顯示，NF-κB的表達在各治療組大鼠的心肌組織中較模型對照組下降，可以推斷ARB類藥物的作用機制中，其中某一環(huán)節(jié)對NF-κB起到了抑制作用。NF-κB的表達被抑制減少了炎性細胞因子的合成與分泌，對降低血壓同樣也起到了一定的作用。

左室重構(gòu)表現(xiàn)為左心室的負荷加重，進而導(dǎo)致心肌做功增加，初期為代償性，隨著病情的惡化，轉(zhuǎn)為失代償狀態(tài)，可引起心肌細胞的肥大，同時還會伴有重量增加以及間質(zhì)纖維的增生。通過細胞以及分子水平的分析可以得知，大體上可以分為3個環(huán)節(jié)，分別是細胞外的信號刺激、細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細胞核內(nèi)部的基因轉(zhuǎn)錄活化。本質(zhì)都是肥大細胞產(chǎn)生刺激信號，并對細胞核內(nèi)的基因表達產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。此外，細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路屬于細胞外刺激以及細胞核內(nèi)的基因活化的偶聯(lián)環(huán)節(jié)，具有非常重要的作用[14]。本實驗中，模型對照組中NF-κB陽性表達明顯高于各個治療組，可以推斷ARB類藥物抑制了心肌組織中NF-κB的激活，宏觀上可以解釋為ARB類藥物可以作為NF-κB的抑制劑。實驗結(jié)束后，各個治療組NF-κB的表達較模型對照組明顯降低，大鼠的血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)、Ⅰ型膠原、 Ⅲ型膠原含量均低于模型對照組?？紤]ARB 類藥物改善左心室的重構(gòu)主要包括以下幾方面的內(nèi)容：①逐漸降低壓力負荷以及心肌局部血管緊張素的含量。由于壓力負荷的不斷下降，能夠減輕心肌肥厚，但這不是主要的原因。Rysa[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用除去血管緊張素以外的肼屈嗪、利血平和氫氯噻嗪的三聯(lián)降壓治療方法能夠降低血壓，并且對心肌肥厚減輕的程度要遠遠小于腎素特異性抑制劑的作用，這說明降壓治療具有一定的意義，但是非壓力負荷容易導(dǎo)致心肌肥厚，這一點是必須要注意的；②降低炎癥反應(yīng)。NF-κB 活化后，可增加炎性細胞因子的合成，炎性細胞因子在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，高血壓的發(fā)生又使得左心室負荷加重，促進左心室重構(gòu)的發(fā)生，環(huán)環(huán)相扣。由于ARB 類藥物可以顯著抑制NF-κB 的活性，從而降低炎癥因子的表達，最終使得心肌肥厚的程度不斷下降。這與Rysa[15]的研究相似，表明ARB類藥物對于降低血壓以及逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)方面有著非常重要的作用。表明對NF-κB 的激活進行干預(yù)，很有可能成為治療高血壓心室重構(gòu)的新靶點。

ARB類藥物結(jié)構(gòu)存在很大的差異，可以分為3類。①三苯四咪類：以氯沙坦為代表，是一種前體藥物，能夠在肝臟中進行逆轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)換成為活性的代謝產(chǎn)物EXP3174，然后可以對血管緊張素的Ⅰ型受體進行選擇性阻斷并不斷地發(fā)揮作用。此外，依貝沙坦、坎地沙坦以及他所沙坦也屬這類藥物；②非三苯四咪喹類：以依普羅沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦為代表，本身即為活性物質(zhì)，不需要生物學(xué)轉(zhuǎn)換；③非雜環(huán)類：以纈沙坦為代表，不是前體藥，能夠直接作用于受體并發(fā)揮相應(yīng)的作用。所謂的類效應(yīng)，至今為止還沒有科學(xué)的、臨床甚至是管理上的定義。因為沒有形成一致的結(jié)論，目前存在很多的解釋。每種藥物都有很多的機制，如果這些藥物的作用機制相同，就屬于同一類藥物。從某一角度來說，可以認為ARB類藥物可通過降低NF-κB的表達來改善心室重構(gòu)的過程，雖然功能基團不同，但具有相似的作用機制，故可以認為在此方面具有類效應(yīng)。本實驗推斷ARB類藥物可以作為NF-κB的抑制劑，心血管疾病如高血壓、冠心病、心力衰竭、心肌病等多種常見病，ARB類藥物均能起到很好的治療作用。本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^ARB類藥物在高血壓中的治療，從逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)方面的研究入手，探討4種ARB類藥物之間是否存在類效應(yīng)的作用，并進一步為NF-κB的表達在高血壓心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用尋找理論依據(jù)。