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    水牛p21基因在卵母細胞體外成熟過程中的表達及其真核表達載體構(gòu)建

    2018-11-02 10:34:46鄭海英黃玥萌楊春艷鄢勝飛李孟琪于農(nóng)淇黃加祥尚江華
    動物醫(yī)學(xué)進展 2018年10期
    關(guān)鍵詞:顆粒細胞水牛卵母細胞

    鄭海英,黃玥萌,楊春艷,鄢勝飛,李孟琪,于農(nóng)淇,鄭 威,黃加祥,尚江華

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所/農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點試驗室,廣西南寧 530001)

    p21作為一種可調(diào)控細胞周期的蛋白,在細胞生長、分化、衰老和死亡過程中發(fā)揮著重要作用,與腫瘤、癌癥也有密切關(guān)系[1]。p21蛋白通過調(diào)控細胞周期來調(diào)節(jié)細胞生長、繁殖、衰老和死亡[2]。當細胞DNA受到損傷時,p21使細胞停滯于G1期,甚至G2期,使細胞有時間對損傷的DNA進行修復(fù),從而維持細胞遺傳信息的穩(wěn)定性[3]。但另一方面,細胞周期的停滯是衰老的前提,若細胞內(nèi)p21增加,則足以引起細胞衰老[4]。自p21被證明對細胞周期具有負調(diào)控作用以來,研究者發(fā)現(xiàn)p21參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展,其表達使腫瘤細胞發(fā)生不可逆的凋亡;同時,p21調(diào)控細胞周期進程和細胞凋亡過程,若缺失或突變會使細胞分裂復(fù)制、細胞內(nèi)和細胞間的運輸及通訊功能喪失,最終導(dǎo)致細胞衰老、死亡或被其他細胞清除[5]。此外,p21在正常組織中的表達也已有大量報道。Guo Q等[6]發(fā)現(xiàn)高表達的p21使干細胞停滯于G1期;而干擾p21后干細胞出現(xiàn)明顯的DNA損傷和細胞凋亡。在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育過程中,p21的作用受到了許多關(guān)注。Moore G D等[7]檢測了小鼠卵母細胞p21的表達變化,發(fā)現(xiàn)在無減數(shù)分裂能力的卵母細胞、有減數(shù)分裂能力的卵母細胞以及停滯于M-Ⅱ期的卵母細胞中,p21的表達量無顯著差異;而在胚胎發(fā)育的第2次有絲分裂的G2期,p21的表達量會較第1次有絲分裂驟增2倍~3倍。p21蛋白的表達以及亞細胞定位均可影響小鼠受精卵G2期向M期的轉(zhuǎn)換[8]。在小鼠胚胎發(fā)育過程中,當胚胎細胞快速增殖時,p21只有極弱的特異性表達信號;而當胚胎器官基本形成后,p21的表達信號增強,有利于抑制這些細胞的增殖速度,使細胞轉(zhuǎn)入進一步的分化[9]。在小鼠卵泡的生長、成熟和閉鎖過程中,p21在卵母細胞中也發(fā)揮了一定的作用,參與優(yōu)勢卵泡的選擇和形成[10]。

    目前,關(guān)于p21與卵母細胞體外成熟減速分裂核進程的研究已涉及小鼠、牛、山羊等多個物種,趙貴民等[11]已在牛卵母細胞成熟的不同時期均檢測到p21 mRNA的表達。水牛是我國南方奶業(yè)的重要優(yōu)勢品種,了解p21基因在水牛卵母細胞體外成熟過程中的表達規(guī)律和相關(guān)功能,為提高水牛胚胎體外生產(chǎn)提供分子生物學(xué)理論和試驗依據(jù),對加快奶水牛品種改良具有重要意義。本研究通過檢測水牛卵母細胞體外成熟過程中p21的表達并構(gòu)建pEGFP-N1-p21真核表達載體,為研究p21在水牛卵母細胞體外成熟中的作用機制及下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)p21基因水牛奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 水牛顆粒細胞和卵丘-卵母細胞復(fù)合物 水牛顆粒細胞:通過對摩拉水牛進行活體采卵,所得的活采液被放置于體式顯微鏡下,挑揀出水牛卵母細胞后,將剩余的活采液進行離心,收集其中的細胞進行體外培養(yǎng)、分離和傳代,所得細胞即為顆粒細胞。水牛卵丘-卵母細胞復(fù)合體由屠宰場水牛卵巢抽取獲得。

    1.1.2 載體與感受態(tài)細胞 pEGFP-N1載體和DH5α感受態(tài)細胞,由廣西水牛研究所遺傳繁育重點試驗室保存。

    1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus、Hind Ⅲ、KpnⅠ、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)、SYBR? Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0、pMD19-T,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;ReverTra Ace-α-?、ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover,Toyobo-東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小提試劑盒,天根化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;無內(nèi)毒質(zhì)粒小量提取試劑盒,Omega公司產(chǎn)品;Cell-to-cDNA Ⅱ Kit、T4 DNA Ligase Kit、LipofectamineTM3000 Transfection Kit、DMEM、FBS、Amp+和Kna+,Life公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 引物的設(shè)計與合成 參照文獻[12]的引物(p21-F:5′-ATCGAAGCTTACAGGTGCCATGTCTGAGCTGT-3′;p21-R:5′-ATCGGGTACCGCGGG- CTTCCTCCTGGAGCAGAT-3′,擴增產(chǎn)物521 bp),擴增水牛p21 CDs區(qū),并在上下游引物中加入Hind Ⅲ、KpnⅠ酶切位點(劃線部分為對應(yīng)酶切位點)。同時參考GenBank中水牛p21 基因mRNA (NM-001098958.2) 序列,利用NCBI primer blast設(shè)計RT-qPCR檢驗擴增引物(F:5′-GAGCGGTGGAACTTCGACTT-3′;R:5′-CAAGTGGTCCTCCTGAGACG-3′,擴增產(chǎn)物186 bp)。內(nèi)參基因選擇β-actin(F:5′-AGCTCGCCATGGATGATGA-3′,R:5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′,擴增產(chǎn)物166 bp)。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

    1.2.2 水牛卵丘-卵母細胞體外成熟培養(yǎng) 從南寧市屠宰場收集水牛卵巢,置于30℃~35℃的生理鹽水中3 h內(nèi)運回實驗室,用 9 g/L的雙抗生理鹽水沖洗3次。用注射器抽取直徑為2 mm~8 mm的水牛卵泡液,在體視顯微鏡下用玻璃吸管吸取卵泡液中帶2層以上卵丘細胞、胞質(zhì)均勻的卵母細胞,在洗卵液(含5 g/L NBS、20 mmol/L Hepes的TCM199)中洗2次,再在經(jīng)平衡過的IVM液(TCM199+100 mL/LFBS+10 μg/mL FSH +12 μg/mL LH+1 μg/mL E2+50 μmol/L巰基乙醇)中洗3次,最終放入干凈的IVM液中,收集IVM不同時期水牛卵母細胞。

    1.2.3 卵母細胞p21 mRNA表達檢測 按照Cell-to-cDNATMⅡ Kit的說明書收集體外成熟不同時期的水牛卵母細胞40個~50個,用4℃ 1×PBS清洗卵母細胞3遍后,放入10 μL 4℃ Cell Lysis Ⅱ buffer,75℃孵育10 min。冰上冷卻后加入DNase Ⅰ,使其終濃度為0.04 U/μL。37℃孵育15 min后75℃孵育5 min使DNaseⅠ失活。再向裂解液中加入4 μL dNTP Mix,2 μL Random Decamers,70℃孵育3 min后向其加入2 μL 10×RT buffer,1 μL M-MLV Reverse Transcriptase,1 μL RNase Inhibitor,42℃ 30 min,95℃ 10 min后直接獲得cDNA,以其為模板進行RT-qPCR檢測。RT-qPCR反應(yīng)體系為:SYBR? Premix ExTaqTM5.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 1.0 μL,ddH2O 3.0 μL,共10.0 μL。反應(yīng)程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 cycles;95℃ 5 s,60℃ 60 s,95℃延伸,讀取熔解曲線。熒光信號由Loche LightCycler 480采集并分析,利用RQ=2-ΔΔCt方法計算p21的相對表達量。

    1.2.4 RT-PCR擴增p21 CDs 按照RNAiso Plus說明書提取摩拉水牛卵巢顆粒細胞總RNA。按照ReverTra Ace-α-?說明書,以摩拉水牛卵巢顆粒細胞總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增反應(yīng)體系:PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0) 10.0 μL,cDNA 2.0 μL,上、 下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL,RNase free H2O 7.0 μL,總體積 20.0 μL。反應(yīng)程序:98℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,35 cycles;72℃ 5 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書回收PCR產(chǎn)物。

    1.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T-p21的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接,反應(yīng)體系:pMD19-T Vector 1.0 μL,回收PCR產(chǎn)物4.0 μL,Solution 5.0 μL,共10.0 μL。16℃孵育30min后轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞,挑取單克隆菌落用Amp+抗性篩選后進行菌液PCR和測序驗證。連接后的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-p21。按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pMD19-T-p21質(zhì)粒備用。

    1.2.6 真核表達載體pEGFP-N1-p21的構(gòu)建 用Hind Ⅲ和KnpⅠ分別雙酶切 pMD19-T-p21質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒后,利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 回收線性化載體。按照 T4 DNA Ligase Kit說 明 書 將 線 性 化 pEGFP-N1與p21 CDs連接。 反應(yīng)體系:線性化pEGFP-N1 1 μL(100 ng),p21 CDs 6 μL(≈500 ng),10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL,T4 DNA Ligase 1 μL(1 U),ddH2O 10 μL,共 20.0 μL。22℃孵育30 min 。連接后的重組質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-p21。轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細胞,挑取單克隆菌落用Kna+抗性篩選后進行菌液PCR。將PCR結(jié)果為陽性的菌液擴大培養(yǎng)后按照天根質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒,進行雙酶切驗證。酶切體系:質(zhì)粒 1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,KpnⅠ 1 μL,10×Fast Digest Green Buffer 2 μL,ddH2O 15 μL,共20 μL。37℃孵育20 min,80℃孵育10 min,終止反應(yīng)。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶切結(jié)果。將酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒所對應(yīng)的菌液擴大培養(yǎng),按照 Omega無內(nèi)毒質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取pEGFP-N1-p21質(zhì)粒備用。

    1.2.7 細胞培養(yǎng) 將保存于液氮的水牛卵巢顆粒細胞取出后立即放入37℃水浴中,緩慢搖動凍存管,在1 min內(nèi)將其融化完全,2000 r/min離心2 min,去除上層凍存液,加入500 μL 90%DMEM+10%FBS 完全培養(yǎng)基,輕輕吹打?qū)⒓毎靹?,再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿,放入37℃、體積分數(shù)為5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待其融合度達90%后以5×105/孔的密度傳代于6孔板中,待融合度達80%后進行轉(zhuǎn)染試驗。

    1.2.8 細胞轉(zhuǎn)染 將提取的無內(nèi)毒pEGFP-N1-p21及pEGFP-N1質(zhì)粒稀釋至濃度1 μg/μL,與空白對照(無質(zhì)粒)同時按LipofectamineTM3000 Transfection Kit說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h和48 h用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。

    1.2.9 轉(zhuǎn)染細胞中p21基因RT- qPCR檢測 提取水牛卵巢顆粒細胞總RNA,按照ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說明書制備cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系為:SYBR? Premix ExTaqTM10.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 5.0 μL,ddH2O 4.0 μL,共20.0 μL。反應(yīng)程序同1.2.2。熒光信號由Loche LightCycler 480采集并分析,利用 RQ=2-ΔΔCt方法計算p21的相對表達量。

    2 結(jié)果

    2.1 水牛卵母細胞體外成熟過程中p21的表達

    按照Cell-to-cDNATMⅡ Kit的說明書收集體外成熟不同時期的水牛卵母細胞40個~50個,直接獲得cDNA,以其為模板進行RT-qPCR檢測。P21 mRNA相對表達情況如表1。以水牛卵母細胞p21在體外成熟培養(yǎng)0 h為基準,在培養(yǎng)6 h時p21表達量最高,與其他時期的差異極顯著(P<0.01),隨后p21表達量降低,12 h~24 h之間無明顯差異。有極體的卵母細胞p21表達量顯著高于無極體的卵母細胞(P<0.05)。

    2.2 p21基因RT-PCR擴增

    以反轉(zhuǎn)錄所得的水牛顆粒細胞cDNA為模板,用引物p21-F和p21-R擴增,目的片段用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,可見一條近500 bp的單一條帶(圖1)。

    表1 水牛卵母細胞體外成熟各時期p21相對表達量

    注:同行數(shù)據(jù)肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01),小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著。

    Note:Values within the same column with different capital letters are extremely significantly different (P<0.01), with different small letters are significantly different(P<0.05),and with same letters are not significantly different.

    2.3 重組質(zhì)粒鑒定及序列測定

    按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書回收PCR 產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,挑選單克隆菌用Amp+進行抗性篩選,菌液PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖2所示,可觀察到大部分菌液樣品均有接近500 bp大小的單一目的條帶。

    將陽性菌液的測序結(jié)果與牛p21基因(NM-001098958.2)序列對比,同源性達99%。如圖3所示,水牛p21 cDNA序列與參考基因相比存在5處突變。

    M.DNA標準DL 2 000;1.陰性對照;2. p21-F和 p21-R PCR產(chǎn)物

    M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control ;2.Products of p21-F and p21-R

    圖1水牛顆粒細胞p21 PCR產(chǎn)物

    Fig.1 PCR products of p21-F and p21-R

    M.DNA標準DL 5 000;1~7. pMD19-T-p21菌液PCR產(chǎn)物

    M.DNA Marker DL 5 000;1-7. PCR products of pMD19-T-p21 bacterial liquid

    圖2 pMD18-T-p21菌液PCR

    Fig.2 PCR identification of pMD18-T-p21 bacterial liquid

    圖3 測序?qū)Ρ冉Y(jié)果

    2.4 真核表達載體構(gòu)建結(jié)果

    用Hind Ⅲ和KnpⅠ分別雙酶切 pMD19-T-p21質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒后,利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 回收線性化載體。按照 InvitrogenTMT4 DNA Ligase說明書將線性化pEGFP-N1與p21 CDs連接。連接后的重組質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-p21。轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細胞,挑取單克隆菌用Kna+進行抗性篩選,將菌液 PCR結(jié)果為陽性的菌液提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切后將酶切產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖4所示,可觀察到質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ酶切后條帶大小正確。

    2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染水牛顆粒細胞

    pEGFP-N1-p21、pEGFP-N1和陰性對照同時操作轉(zhuǎn)染水牛顆粒細胞,于24 h和48 h在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光。24 h熒光表達如圖5所示,陰性對照組未觀察到綠色熒光;pEGFP-N1-p21、pEGFP-N1均有綠色熒光蛋白表達。轉(zhuǎn)染試驗重復(fù)3次,均得到一致結(jié)果,表明重組質(zhì)粒pEGFP-N1-p21成功轉(zhuǎn)染至顆粒細胞中并表達出綠色熒光蛋白,證明pEGFP-N1-p21真核表達載體構(gòu)建成功。

    2.6 轉(zhuǎn)染細胞中p21基因RT-qPCR檢測

    收集轉(zhuǎn)染48 h后的水牛顆粒細胞提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板進行RT- qPCR檢測,p21表達情況如圖6。在空白對照p21表達量與pEGFP-N1差異不顯著,與pEGFP-N1-p21差異極顯著;pEGFP-N1與pEGFP-N1-p21差異極顯著(P<0.01)。

    M.DNA標準DL 10 000;1. pEGFP-N1-p21雙酶切;2.Hind Ⅲ酶切pEGFP-N1-p21;3.KpnⅠ酶切pEGFP-N1-p21

    M.DNA標準DL 10 000;1.Double enzyme digestion of pEGFP-N1-p21;2.pEGFP-N1-p21 digested withHind Ⅲ;3.pEGFP-N1-p21 digested withKnpⅠ

    圖4 pEGFP-N1-p21雙酶切結(jié)果

    Fig.4 Double enzyme digestion results of pEGFP-N1-p21

    A.pEGFP-N1-p21轉(zhuǎn)染;B.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染;C.空白對照;A’、B’、C’.對應(yīng)明場

    A.pEGFP-N1-p21 transfection;B.pEGFP-N1 transfection;C.Blank control;A’,B’,C’.Transfection with pEGFP-N1-p21,pEGFP-N1 and blank under the common light respectively

    圖5綠色熒光蛋白表達情況

    Fig.5 Expression of green fluorescent protein

    與對照組比較,**表示差異極顯著(P<0.01)

    Compared with control group( **P<0.01)

    圖6顆粒細胞轉(zhuǎn)染效率

    Fig.6 Transfection efficiency of ovarian granulosa cells

    3 討論

    p21在卵子成熟過程中的作用在多年前已有大量研究。Frank-Vaillant M等[13]對爪蟾卵子的研究提示高水平p21蛋白可間接誘導(dǎo)卵子減數(shù)分裂G2/M期轉(zhuǎn)換受到阻滯。許曉磊[14]將牛pVenus-p21真核表達載體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物注射入體外成熟培養(yǎng)8 h的牛卵母細胞中,使得牛卵母細胞成熟率出現(xiàn)明顯降低;而在對卵子內(nèi)p21進行干擾后發(fā)現(xiàn)牛卵母細胞成熟率上升。趙貴民[12]在mRNA水平上分析了牛p21在減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育不同時期的表達量,發(fā)現(xiàn)p21在MⅠ期和MⅡ期的表達量逐漸升高,進入胚胎發(fā)育階段后表達量下降,到8細胞期后又再次上升,到達囊胚期時表達量最高。本研究在水牛卵母細胞體外成熟過程中的0、6、12、24 h分別對其檢測了p21 mRNA的表達水平,在6 h時p21 mRNA的表達量最高,可能是由于在6 h之前卵母細胞大多數(shù)仍處于GV期,此時卵母細胞正被阻滯在第1次減數(shù)分裂前期的雙線期,這正是p21高表達的結(jié)果。隨后p21表達量急劇降低,并從12 h~24 h p21表達量有緩慢上升的趨勢,但差異不顯著。IVM前12 h是水牛卵母細胞GVBD的發(fā)生時期,其間卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂并進入MⅠ期。后12 h卵母細胞從MⅠ期隨第1極體的排出進入MⅡ期。此時卵母細胞又進入停滯期,直到受精或給予適當刺激時才能解除停滯并恢復(fù)第2次減數(shù)分裂[15]。故而本研究檢測到的水牛卵母細胞體外成熟的12 h~24 h期間p21的表達量與上述的規(guī)律基本符合,與趙貴民的研究結(jié)果一致。此外,本研究檢測到在排出了第1極體的卵母細胞中,p21 mRNA的表達量顯著高于未排出第1極體的卵母細胞(P<0.05),這也可能是由于這些未排出第1極體的卵母細胞在G2/M轉(zhuǎn)換的過程中受到某些干擾而未能按時完成第1次減數(shù)分裂。

    屠宰場來源水牛卵巢的卵母細胞GVBD的發(fā)生具有不均一性[16],是導(dǎo)致體外生產(chǎn)水牛胚胎成功率顯著降低的重要原因。而在本研究中,p21在GVBD時期(IVM前12 h)的表達發(fā)生了較大變化,這樣的變化是否對卵母細胞的成熟率、受精后的分裂率等有影響還需更進一步的研究。Shang J H等[17]已成功從水牛卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs)中克隆出p21 CDs,并對其進行了生物信息學(xué)分析。本研究在其基礎(chǔ)上從摩拉水牛顆粒細胞中克隆出p21 CDs并構(gòu)建出pEGPF-N1-p21真核表達載體,轉(zhuǎn)染水牛顆粒細胞后可見綠色熒光,且p21 mRNA的表達量極顯著升高(P<0.01),表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,既可表達綠色熒光蛋白,也可轉(zhuǎn)錄出p21 mRNA。p21蛋白的表達量還需后續(xù)試驗驗證。本研究為進一步研究p21在水牛卵母細胞體外成熟以及胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。

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