骨髓間充質干細胞培養(yǎng)上清液在未成熟鼠腦損傷中的免疫調節(jié)作用

疏佳萍，柏文華，蔣犁

(東南大學附屬中大醫(yī)院 兒科，江蘇 南京 210009)

骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)具有高度增殖及多向分化潛能，可分化為神經膠質細胞及神經元樣細胞等[1]。動物實驗發(fā)現，BMSCs移植可以改善缺氧缺血腦損傷的炎癥反應[2]，但是干細胞的直接移植存在細胞變異分化瘤變可能及形成細胞栓等問題。本研究旨在通過定向注射BMSCs上清液干預腦損傷模型，檢測炎癥因子分泌濃度，進一步探討B(tài)MSCs旁分泌作用干預早產兒腦損傷的作用機制，為干細胞技術應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰酶(EDTA，美國Gibco公司)，MEM培養(yǎng)基、青霉素- 鏈霉素雙抗、PBS(美國Hyclone公司)，HE相關試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(杭州聯科生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體重80～100 g,4～5周齡，用于分離培養(yǎng)BMSCs;新生3 d SD大鼠，用于制作早產兒腦損傷模型;所有實驗動物均由南京祥鴻生物有限公司提供，實驗動物的處理方法均符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs原代分離培養(yǎng)及純化 全骨髓貼壁法[3]培養(yǎng)BMSCs,水合氯醛麻醉大鼠，75%酒精浸泡消毒5 min后移至超凈臺，通風櫥內無菌條件下取雙側鼠股骨、脛骨浸入PBS中。1 ml注射器抽取PBS反復沖洗至髓腔發(fā)白，沖洗過程中可見紅色渾濁液體流出。收集混合液，室溫條件下1 500×g離心7 min,棄去上清液，用完全培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基+10%FBS+1%雙抗)重懸沉淀，細胞計數，按照4 000 cm-2接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后首次半量換液，每隔48～72 h全量換液，待細胞融合70%～80%，0.25%EDTA消化，等量完全培養(yǎng)基中和EDTA，1 500×g離心7 min收獲細胞，完全培養(yǎng)基重懸細胞，1∶2或1∶3接種于新培養(yǎng)瓶。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況。取P3代細胞待用，BMSCs鑒定參考本實驗室所發(fā)表文章[4]。

1.2.2 動物模型制備、實驗分組及取材 模型制作：改良Longa線栓法栓塞左側頸總動脈，腦缺血1 h后進行混合氣(94%N2+6%O2)通氣2 h造缺氧模型，術后24 h參考Bederson JB評分行神經功能缺損評分，評分2～4分視為模型制作成功。分組：將新生3 d SD大鼠隨機分為對照組(A組)、PBS干預組(B組)和上清液干預組(C組)，每組8只。A組僅制作早產兒缺氧缺血腦損傷模型，無其他干預；B組制作早產兒缺氧缺血腦損傷模型，術后側腦室定向注射PBS；C組制作早產兒缺氧缺血腦損傷模型，術后側腦室定向注射培養(yǎng)BMSCs的上清液。實驗取材：七氟烷吸入麻醉后取乳鼠全腦作病理切片材料，取部分乳鼠左側腦超聲波下所制腦勻漿作ELISA實驗材料。

1.2.3 HE染色觀察各實驗組大腦病理改變 (1)石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自來水洗；(2)蘇木素染色：蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，水洗；(3) 伊紅染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水，入伊紅染液中染色5 min；(4)脫水封片：切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、 二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片；(5)顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.4 檢測白細胞介素- 6(interleukin- 6, IL- 6)及轉化生長因子- β(transforming growth factor- β,TGF- β)分泌濃度 (1)準備所有的試劑和標準品；(2)復孔加入100 μl 2倍倍比稀釋的標準品，空白孔加入100 μl 1× 檢測緩沖液，樣本孔加入50 μl 1×檢測緩沖液和50 μl預稀釋的樣本；(3)每孔加入50 μl稀釋的檢測抗體，室溫孵育1.5 h，洗滌6次；(4)每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min，洗滌6次；(5)每孔加入100 μl顯色底物，避光，室溫孵育5～30 min；(6)每孔加入100 μl終止液，30 min內在450 nm波長檢測OD值，參考波長630 nm。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，對于重復測量數據采用重復測量的方差分析進行比較，并且采用bonferroni的兩兩比較進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)48 h內由于培養(yǎng)基渾濁無法觀察細胞形態(tài)，96 h后細胞數量減少，形態(tài)較小，有少量突起，呈小梭型，聚集生長。7～8 d后細胞融合70%～80%。傳代后細胞生長迅速，12 h后細胞可基本全部貼壁、伸展、均勻分布，細胞呈梭型、漩渦狀生長。傳至第3代細胞融合80%～90%時，可見細胞生長良好，細胞呈梭型、漩渦狀生長(圖1)。收集第3代培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，1 500×g離心7 min，棄去脫落細胞及培養(yǎng)基中殘物等沉淀，取上清液供本研究使用。

圖1BMSCs形態(tài)×100

2.2 大腦組織病理切片

HE染色結果顯示A組側腦室擴張，海馬區(qū)結構變異明顯；C組側腦室擴張程度較A組小，海馬結構變異程度不明顯。見圖2。

2.3 不同時間點各組腦勻漿上清液IL- 6、TGF- β含量的比較

B組與A組相比， 1、3、5 d IL- 6含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組各時間點的IL- 6含量均低于A、B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明BMSCs上清液干預有效。同一組在不同時間點與該組第1天相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組3 d與5 d比較， IL- 6含量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

圖2第5天時各實驗組側腦室鏡下染色形態(tài)HE×100

表1不同時間點各組IL-6含量比較pg·ml-1

與C組比較，aP<0.01；與同組1 d比較，bP<0.05；與同組3 d 比較，cP<0.05

B組與A組相比，各時間點的TGF- β表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組各時間點的TGF- β含量均低于A、B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同一組在不同時間點與該組第1天相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2不同時間點各組TGF-β含量比較pg·ml-1

與C組比較，aP<0.01；與同組1 d比較，bP<0.05

3 討 論

近年來，隨著早產兒發(fā)生率的逐漸上升[5]，以及早產兒存活率的顯著提高，早產兒腦損傷的發(fā)生率也隨之增加，其中腦白質損傷(white matter injury, WMI)是最重要的腦損傷類型[6]，其病因和發(fā)病機制極其復雜，常見于胎齡24～32周的早產兒[7]。WMI可導致腦癱，認知、行為、視覺和聽力障礙等[8- 9]。迄今國內外對早產兒WMI的治療方法仍處于研究階段，其生存質量的改善是國際性的重點攻克目標。

BMSCs是存在于骨髓中的非造血成體干細胞，具有多向分化潛能，在特定的誘導環(huán)境下可向軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等方向進行分化[10]。 因此 BMSCs 移植入體內分化為功能細胞替代受損細胞被認為是移植治療的主要機制。但是近年來,隨著對 BMSCs 生物學作用研究的深入,學術界認為 BMSCs 參與組織損傷修復可能通過至少兩種方式：分化替代機制和旁分泌機制,并且 BMSCs 的旁分泌機制可能在組織修復中發(fā)揮著比分化替代更為關鍵的作用[11]。BMSCs旁分泌的生物活性因子主要有生長因子及其受體如VEGF,細胞因子和趨化因子等[12]。

機體多種細胞均可分泌非活性狀態(tài)的TGF- β，一般在細胞分化活躍的組織常含有較高水平的TGF- β。TGF- β的生物學功能研究主要在炎癥、組織修復和胚胎發(fā)育等方面[13]，近年來發(fā)現TGF- β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節(jié)作用。本研究發(fā)現，BMSCs上清液移植后第5天，TGF- β表達較PBS干預組明顯上升，說明BMSCs上清液的神經保護作用可能與改變TGF- β的表達量有關?？赡苡捎趥€體差異導致TGF- β含量不同，也可能由于TGF- β隨炎癥刺激而激發(fā)神經免疫反應的增高，造成各時間點TGF- β含量不同。說明BMSCs上清液干預腦損傷模型后可以促進保護性因子TGF- β的分泌。

目前，已有研究明確顯示TGF- β在成人腦組織中具有神經保護功能[14]，但其在早產兒腦損傷中的研究尚未闡明。合理掌握和應用TGF- β保護和損傷作用的分界點，既要發(fā)揮神經保護作用，同時抑制其損傷效應，這是未來早產兒腦損傷新靶點治療的研究方向。

IL- 6調節(jié)多種細胞的生長與分化，調節(jié)免疫應答、急性期反應及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應中起重要作用。神經炎癥是腦損傷的重要病理表現，形成的過度炎癥級聯反應破壞血腦屏障，損傷腦神經細胞并影響損傷部位生理功能[15]。本研究發(fā)現BMSCs移植后第3天上清液干預組IL- 6較PBS干預組明顯下降，說明上清液的神經保護作用可能與抑制IL- 6的釋放有關?？赡苡捎趥€體差異造成IL- 6含量不同，也可能由于炎癥因子激發(fā)體內保護機制，造成各時間點IL- 6含量不同。初步預示BMSCs上清液干預腦損傷模型后可以抑制促炎因子IL- 6的分泌。

綜上所述，側腦室立體定向移植BMSCs上清液可改善腦損傷后的神經炎癥反應，可能與移植BMSCs上清液后腦組織中IL- 6和TGF- β表達水平的變化有關。但移植后BMSCs上清液抑制IL- 6表達、促進TGF- β表達的機制尚不清楚，可能與BMSCs通過旁分泌作用使上清液內含有營養(yǎng)性因子或傳遞相關炎癥信號的物質有關，我們后續(xù)將進一步實驗探索。