肺炎患者體內(nèi)肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素分析

楊文平，劉爽，王海濱，亓玉心，劉長江，周玉法

(萊蕪市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，山東 萊蕪 271100)

近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，機械通氣技術(shù)、導(dǎo)管技術(shù)等逐漸發(fā)展，已成為臨床中常見的治療技術(shù)。但由此而引發(fā)的感染性疾病也日漸增多，已成為全球突出性的醫(yī)療衛(wèi)生問題。同時，革蘭陰性菌的感染率也逐漸升高，其中醫(yī)務(wù)人員最為重視的屬肺炎克雷伯菌，這種腸桿菌科克雷伯菌屬細(xì)菌已成為醫(yī)院及社區(qū)中引發(fā)感染性疾病最多的菌種[1- 3]?？死撞梢l(fā)人類嚴(yán)重的腸道疾病，亦可導(dǎo)致肺炎、敗血癥、尿道炎、外源性感染等疾病[4- 5]。臨床上常采用廣譜抗生素類藥物殺滅肺炎克雷伯菌[6- 7]，但抗生素的濫用又使得肺炎克雷伯菌的耐藥性提高，已有多篇文獻對肺炎克雷伯菌的耐藥基因和基因亞型進行了報道[8- 9]。使用抗生素對肺炎克雷伯菌進行抑制還可能出現(xiàn)菌血癥和內(nèi)毒素血癥兩個致死因素[10]。通過提高抗菌藥物治療的有效率和敏感性，菌血癥的發(fā)生率已顯著降低[11]。但因細(xì)胞內(nèi)毒素的釋放而引發(fā)的休克癥狀和患者死亡率仍居高不下，有研究表明這種現(xiàn)象的發(fā)生與細(xì)菌內(nèi)毒素進入人體血液循環(huán)系統(tǒng)有關(guān)[12]。同時，不同的抗菌藥物所引發(fā)的內(nèi)毒素釋放量也有顯著差異。因此，本研究致力于探索肺炎患者體內(nèi)肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素，為臨床治療中合理選擇抗菌藥物、制定治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 EDS- 99細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀(北京金山川科技發(fā)展有限公司)；鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號0110152)，細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥物生物制品檢定所，批號2015- 7)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司，批號0401130)。

1.1.2 藥物 乳酸環(huán)丙沙星注射液(廣州南新制藥有限公司，批號CFI 00303)，注射用美羅培南(日本住友制藥株式會社，批號EK 147)，頭孢曲松鈉(上海羅氏制藥有限公司，批號SH 0359)，硫酸慶大霉素注射液(華北制藥集團制劑有限公司，批號030801)。

1.1.3 菌株 肺炎克雷伯菌CMCC(B)46117，我院微生物室保存株。

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素的Logistic回歸分析 查閱文獻，確定可能對肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素產(chǎn)生影響的因素進行單因素和Logistic回歸分析?？赡苡绊懸蛩赜邢♂対舛?、培養(yǎng)時間、抗菌藥物聯(lián)用和不同培養(yǎng)基。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)株菌液的制備 在M- H瓊脂平板上接種肺炎克雷伯菌，在35 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h后，挑取單個菌落，接種于5 ml M- H肉湯中，直至渾濁，麥?zhǔn)媳葷岷蠛繛?06～9cfu·ml-1。

1.2.3 體外藥物敏感實驗 根據(jù)二倍稀釋法分別測定4種抗菌藥物及兩種聯(lián)合抗菌藥物(環(huán)丙沙星+美羅培南、頭孢曲松鈉+慶大霉素)的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至5.00 EU·ml-1、0.50 EU·ml-1和0.05 EU·ml-1，取相同劑量與鱟試劑混合后進行檢測。

1.2.5 內(nèi)毒素釋放的測定 根據(jù)實驗要求，設(shè)定抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度梯度、培養(yǎng)時間、抗菌藥物單用或聯(lián)用，培養(yǎng)結(jié)束后取出樣品稀釋10 000倍，采用動態(tài)比濁法鱟實驗測定內(nèi)毒素釋放量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

對本實驗的所有檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，分析軟件使用SPSS 21.0，肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素運用Logistic回歸分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素影響因素的單因素分析

通過單因素分析可知，抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度、培養(yǎng)時間和兩種抗菌藥物聯(lián)用是影響因素，但肺炎克雷伯菌培養(yǎng)基的不同不是影響因素，見表1。

表1肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素影響因素的單因素分析

Tab1Oneway-ANOVAoffactorsaffectingendotoxinreleasefromKlebsiellapneumoniae

相關(guān)因素內(nèi)毒素釋放量/EU·ml-1F/t值P值抗菌藥物稀釋濃度 1倍MIC1 419±284 10倍MIC703±1034.1050.009 100倍MIC584±91培養(yǎng)時間 4 h及以下592±92-3.7170.014 4 h以上1 200±268抗菌藥物聯(lián)用 是348±24-11.146<0.001 否806±67M-H肉湯培養(yǎng)基 是1 583±2450.4270.687 否1 502±219

2.2 肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素影響因素的Logistic回歸分析

通過Logistic回歸分析可知，抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度、培養(yǎng)時間和兩種抗菌藥物聯(lián)用是肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素，見表2。

2.3 各抗菌藥物單用和聯(lián)用的MIC

通過體外藥物敏感實驗得出各抗菌藥物單用或聯(lián)用的MIC分別為：環(huán)丙沙星0.030 3 mg·L-1，美羅培南0.011 3 mg·L-1，頭孢曲松鈉0.064 3 mg·L-1，慶大霉素0.550 1 mg·L-1，環(huán)丙沙星+美羅培南0.132 4 mg·L-1，頭孢曲松鈉+慶大霉素0.639 2 mg·L-1。

2.4 抗菌藥物不同稀釋濃度對內(nèi)毒素釋放量的影響

通過Logistic回歸分析可知，抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度是肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素。實驗驗證結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)時間為4 h，單獨使用抗菌藥物時，細(xì)菌釋放內(nèi)毒素量大小順序為1倍MIC>10倍 MIC>100倍MIC，具體結(jié)果如表3所示。

2.5 不同培養(yǎng)時間對內(nèi)毒素釋放量的影響

通過Logistic回歸分析可知，培養(yǎng)時間是肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素。實驗驗證結(jié)果顯示，當(dāng)抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度為10倍MIC，單獨使用抗菌藥物時，抗菌藥物作用時間越長，內(nèi)毒素釋放量越大，見表4。

2.6 不同抗菌藥物使用方法對內(nèi)毒素釋放量的影響

通過Logistic回歸分析可知，兩種抗菌藥物聯(lián)用是肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素。實驗驗證結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)時間為4 h，抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度為10倍MIC時，單獨使用環(huán)丙沙星和美羅培南，比兩者聯(lián)合使用釋放的內(nèi)毒素量多；單獨使用頭孢曲松鈉和慶大霉素，比兩者聯(lián)合使用釋放的內(nèi)毒素量多，見表5。

表2肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素影響因素的Logistic回歸分析

Tab2LogisticregressionanalysisoffactorsaffectingendotoxinreleasefromKlebsiellapneumoniae

相關(guān)因素參數(shù)估計標(biāo)準(zhǔn)誤χ2值P值OR值95% CI抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度0.475 70.274 24.435 20.030 31.4121.078～2.561培養(yǎng)時間0.452 60.374 85.274 30.025 52.0951.861～2.957兩種抗菌藥物聯(lián)用0.487 50.356 54.984 70.047 52.6721.901～3.012

表3不同稀釋濃度對內(nèi)毒素釋放量的影響EU·ml-1

Tab3EffectofdifferentdilutionconcentrationonreleaseofendotoxinEU·ml-1

表4不同培養(yǎng)時間對內(nèi)毒素釋放量的影響EU·ml-1

Tab4EffectofdifferentculturetimeonreleaseofendotoxinEU·ml-1

表5不同抗菌藥物使用方法對內(nèi)毒素釋放量的影響

Tab5Effectsofdifferentantimicrobialagentsonendotoxinrelease

抗菌藥物內(nèi)毒素釋放量/EU·ml-1t/χ2值P值環(huán)丙沙星5 640±284美羅培南9 298±41022.345<0.001環(huán)丙沙星+美羅培南1 760±99頭孢曲松鈉7 583±301慶大霉素941±5540.956<0.001頭孢曲松鈉+慶大霉素428±31

3 討 論

肺炎克雷伯菌屬于克雷伯菌屬中的7個亞種之一，為重要的條件型致病菌，正常人的肺炎克雷伯菌帶菌率約為5%，住院患者因抵抗力降低，加之醫(yī)院為各種病菌的聚集地，帶菌率約為20%。肺炎克雷伯菌在臨床中常引發(fā)肺炎、支氣管炎、外科傷口感染等疾病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者多個內(nèi)臟器官衰竭，對患者生命安全帶來極大的威脅。且在革蘭陰性菌感染疾病中，約有90%的疾病均為肺炎克雷伯菌導(dǎo)致。因此，對肺炎克雷伯菌的研究已成為當(dāng)今的熱點。

近年來，由于醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，多種抗菌類藥物已被應(yīng)用于肺炎克雷伯菌的抑制中，由此引發(fā)了肺炎克雷伯菌的耐藥性不斷提高。有研究表明，肺炎克雷伯菌的耐藥性與其自身的主動外排系統(tǒng)、金屬酶等有關(guān)，其中聯(lián)系最為密切的是超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)。抗生素類藥物使肺炎克雷伯菌耐藥性增強的同時，細(xì)胞內(nèi)毒素的釋放也成為了人們關(guān)注的問題，內(nèi)毒素可引發(fā)患者內(nèi)毒素血癥，增加休克發(fā)生率和死亡率。已有研究報道，單用或聯(lián)用不同濃度的抗菌類藥物，內(nèi)毒素的釋放量也會不同。因此，本研究致力于利用Logistic回歸分析探究肺炎患者體內(nèi)肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素，并設(shè)計體外實驗對影響因素進行驗證，為合理使用抗菌藥物提供理論依據(jù)。

目前常用的細(xì)胞內(nèi)毒素檢測方法包括終點比色法、動態(tài)比色法和動態(tài)比濁法[13]。有研究表明，動態(tài)比濁法相比終點比色法具有更高的靈敏度和更大的測試范圍，相比動態(tài)比色法具有更強的抗干擾能力[14]。因此本研究中選取動態(tài)比濁法對細(xì)胞內(nèi)毒素進行定量檢測，以提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

通過對肺炎患者體內(nèi)肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素進行Logistic回歸分析可知，抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度、培養(yǎng)時間和兩種抗菌藥物聯(lián)用是肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素，是否使用M- H肉湯培養(yǎng)基不對肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素產(chǎn)生影響。當(dāng)培養(yǎng)時間為4 h，單獨使用抗菌藥物時，細(xì)菌釋放內(nèi)毒素量大小順序為1倍MIC>10倍MIC>100倍MIC，說明低濃度的抗菌藥物能夠?qū)Ψ窝卓死撞a(chǎn)生誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)其釋放更多的細(xì)菌內(nèi)毒素。相關(guān)文獻表明，當(dāng)抗菌藥物作用于細(xì)菌時，不僅僅能夠通過殺死細(xì)菌細(xì)胞，使其細(xì)胞壁發(fā)生破裂而導(dǎo)致內(nèi)毒素得到釋放，還有可能是低濃度的抗菌藥物通過其他作用機制，使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)毒素釋放出來[15]。因此，在臨床治療中確定抗菌藥物濃度時，要根據(jù)患者情況給予足夠的抗菌藥物濃度，一方面有助于徹底消滅細(xì)菌，控制患者感染情況，另一方面也能避免細(xì)菌細(xì)胞中內(nèi)毒素的釋放對患者機體功能產(chǎn)生影響。

當(dāng)抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度為10倍MIC，單獨使用抗菌藥物時，細(xì)菌釋放內(nèi)毒素量大小順序為8 h>4 h>2 h>1 h。即抗菌藥物作用時間越長，內(nèi)毒素釋放量越大。有研究表明，當(dāng)抗菌藥物作用于人體時間過長時，殺死細(xì)菌數(shù)量加大，因此細(xì)菌死后，胞內(nèi)內(nèi)毒素釋放量增多[16]。同時，當(dāng)長時間使用同一種抗菌藥物作用于人體時，可使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使得抗菌效果大大降低，患者感染癥狀加重。因此，在臨床中對肺炎患者使用抗菌藥物時，應(yīng)明確抗菌藥物的使用時間，保證抗菌效果的同時，避免患者產(chǎn)生抗菌藥物耐藥性，影響抗菌效果。

當(dāng)培養(yǎng)時間為4 h、抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度為10倍MIC時，單獨使用環(huán)丙沙星和美羅培南，比兩者聯(lián)合使用釋放的內(nèi)毒素量多；單獨使用頭孢曲松鈉和慶大霉素，比兩者聯(lián)合使用釋放的內(nèi)毒素量多。Goscinski等[17]的研究結(jié)果表明，不同抗菌藥物殺滅細(xì)菌時誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞釋放內(nèi)毒素數(shù)量的差異可能與各抗菌藥物殺菌時的工作機制不同有關(guān)。氨基糖苷類抗菌藥物殺滅細(xì)菌時僅對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生抑制作用，不對細(xì)胞的細(xì)胞壁產(chǎn)生破壞，因此殺菌后內(nèi)毒素釋放量較低。氟喹諾酮類抗菌藥物可以破壞內(nèi)毒素與外膜磷脂分子之間的聯(lián)系，使兩者之間穩(wěn)定性降低，進而降低細(xì)胞內(nèi)毒素的釋放量[18]。但其抑制內(nèi)毒素釋放的效果相比氨基糖苷類略差。因此如本研究中結(jié)果顯示，不同的抗菌藥物聯(lián)用時，抑制細(xì)胞內(nèi)毒素釋放的效果相比單獨使用抗菌藥物大大增強。當(dāng)美羅培南作用于肺炎克雷伯菌時，細(xì)胞內(nèi)毒素的釋放量顯著高于其他抗菌藥物，達到(9 298±410)EU·ml-1。因為美羅培南屬于β- 內(nèi)酰胺類抗生素，這種抗菌藥物的作用機制是與青霉素結(jié)合蛋白(PBPS)結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞壁的合成過程受到抑制，故而殺滅細(xì)菌。因此，當(dāng)美羅培南作用于肺炎克雷伯菌時，細(xì)菌細(xì)胞壁合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)毒素完全釋放，因此相比其他抗菌藥物內(nèi)毒素釋放量較高[19]。臨床上常用的β- 內(nèi)酰胺類抗生素還包括頭孢唑肟、氟氧頭孢鈉等[20]，在臨床使用時應(yīng)嚴(yán)格控制此類抗生素的使用劑量、作用時間，避免增加內(nèi)毒素的釋放量而引發(fā)內(nèi)毒素血癥，對患者生命健康造成威脅。

綜上所述，抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株液稀釋濃度、培養(yǎng)時間和兩種抗菌藥物聯(lián)用是肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素，是否使用M- H肉湯培養(yǎng)基不對肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素產(chǎn)生影響。同種抗菌藥物相同時間下細(xì)菌釋放內(nèi)毒素量大小順序為1倍MIC>10倍MIC>100倍MIC，同種抗菌藥物相同濃度下細(xì)菌釋放內(nèi)毒素量大小順序為8 h>4 h>2 h>1 h，相同時間和濃度下單獨使用抗菌藥物比聯(lián)合使用細(xì)菌釋放內(nèi)毒素量更多。在臨床上選用肺炎克雷伯菌抗菌藥物時，應(yīng)結(jié)合肺炎克雷伯菌釋放內(nèi)毒素的影響因素，合理選用抗菌藥物。