骨髓細(xì)胞參與肝癌新生血管的構(gòu)建

邵茜雯，朱海濤，凌蕓，徐靜

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210029；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤研究所 普外科，江蘇 南京 210009；3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)學(xué)部，江蘇 南京 210029)

血管新生是肝細(xì)胞肝癌的重要特性，肝癌進(jìn)展時(shí)骨髓動(dòng)員明顯，但骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs)是否參與肝癌血管新生還不明確[1]。我們通過(guò)細(xì)胞示蹤技術(shù)，觀察BMSCs是否參與肝癌細(xì)胞(hepatic cells cancer, HCC)的血管新生。

1 材料與方法

1.1 材料

流式抗體AlexaFluor488- CD133、PE- 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(PE- VEGFR2)、PE- CD34購(gòu)自eBioscience公司，大鼠抗小鼠CD31單抗、PE標(biāo)記羊抗大鼠二抗購(gòu)自ABCOM公司，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)- ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。C57BL/6小鼠70只，雄性，體重18～22 g；骨髓供體：eGFP轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠10只，雌性，體重18～22 g。小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原位肝癌模型制作[2]小鼠稱(chēng)重后，自右下腹腹腔注射鹽酸氯胺酮(42 mg·kg-1)麻醉小鼠。麻醉成功后仰臥位固定小鼠，自劍突向下1.0 cm切開(kāi)，提起腹壁，以無(wú)菌棉簽固定肝臟，肝內(nèi)注射2×105個(gè)H22細(xì)胞(總量0.2 ml)(上海細(xì)胞研究所)。對(duì)照組:小鼠麻醉后肝內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 ELISA測(cè)定血清VEGF濃度 上述原位肝癌建模后14 d尾靜脈采血，對(duì)照組在同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈采血作為對(duì)照，4 ℃靜止半小時(shí)后4 ℃ 2 000 r·min-1離心5 min，取上清保存后統(tǒng)一測(cè)定，具體按ELISA說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 原位肝癌建模后14 d，模型組以及對(duì)照組小鼠均從尾靜脈采血300 μl，加入等量紅細(xì)胞裂解液，震蕩5 min后4 ℃ 2 000 r·min-1離心5 min，小心吸取沉淀細(xì)胞并重懸于0.5 ml PBS中。按說(shuō)明書(shū)添加流式抗體AlexaFluor488- CD133、PE- VEGFR2和PE- CD34，室溫下避光保存30 min后上機(jī)測(cè)定CD133+VEGFR2+和CD133+CD34+細(xì)胞的百分比。

1.2.4 建立GFP+骨髓的小鼠原位肝癌模型[3]受體小鼠11 Gy照射后2 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射2×106個(gè)GFP+BMSCs(0.2～0.3 ml)，SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)4周后按上述方法建立肝癌模型。

1.2.5 肝組織病理學(xué)檢查 肝癌建模7 d及14 d后處死小鼠取肝臟，冷凍切片2 μm，分別進(jìn)行HE及免疫熒光染色。

1.2.6 RT- PCR 肝癌建模后14 d取肝組織，酚-氯仿法抽提總RNA，ExScriptTM逆轉(zhuǎn)錄(TaKaRa日本)合成cDNA。引物由TakaRa公司設(shè)計(jì)合成。CD133：5′- AACGTGGTCCAGCCGAATG- 3′，5′- TCCCAGGATGGCGCAGATA- 3′；CD34：5′- ACCCACCGAGCCATATGCTTAC- 3′，5′- GATACCCTGGGCCAACCTCA- 3′；β- actin：5′- CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC- 3′，5′- ATGGAGCCACCGATCCACA- 3′。采用SYBR?GreenⅠ嵌合法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 免疫熒光 肝癌建模后7、14 d取肝組織，快速冰凍后5 μm切片，室溫固定，封閉液孵育后加一抗CD31(1∶800)4 ℃過(guò)夜。熒光二抗(1∶1 000)室溫孵育35 min。二脒基苯基吲哚(DAPI)染核，高倍鏡下計(jì)數(shù)GFP+CD31+細(xì)胞在血管內(nèi)皮中的比率。摻入率=GFP陽(yáng)性核/所有內(nèi)皮細(xì)胞核×100%。

1.2.8 Western blotting 肝癌建模后14 d取肝癌與癌旁組織并提取蛋白，上樣100 μg，常規(guī)聚丙烯酰胺電泳、轉(zhuǎn)膜，加一抗(1∶200)4 ℃過(guò)夜后加二抗(1∶1 000)，X線 膠片顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織病理

建模7 d后肝臟出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)，鏡下見(jiàn)典型的肝癌病理特征，腫瘤新生血管明顯。

2.2 肝癌模型小鼠血清VEGF和BMSCs水平

肝癌建模后14 d血清VEGF濃度為(175.13±52.34)pg·ml-1，顯著高于對(duì)照組的(81.65±32.71)pg·ml-1(P<0.05)，同時(shí)循環(huán)CD133+CD34+和CD133+VEGFR2+細(xì)胞明顯升高，分別為(0.27±0.13)%和(0.16±0.08)%，顯著高于對(duì)照組的(0.07±0.04)%和(0.08±0.06) %(P<0.01)。

2.3 建立GFP+骨髓的原位肝癌模型

肝癌小鼠有核細(xì)胞GFP陽(yáng)性率為95%～98%，表明骨髓標(biāo)記成功。建模后14 d腫瘤中出現(xiàn)大量綠色熒光，直接證明BMSCs動(dòng)員后富集于肝癌組織中(圖1)。同時(shí)肝癌組織中BMSCs表型基因CD133、CD34水平顯著高于無(wú)瘤組織。

A.肝癌組織HE染色結(jié)果(×50，2 μm)；B.A在熒光顯微鏡下圖像，腫瘤組織中出現(xiàn)GFP(×100)T為肝癌組織，N為正常組織

圖1原位肝癌組織快速冰凍切片

2.4 肝癌新生血管中的BMSCs

CD31是血管內(nèi)皮特異性抗原，鏡下腫瘤血管內(nèi)皮中存在CD31+GFP+細(xì)胞，這是內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于BMSCs的直接證據(jù)(圖2)。隨著腫瘤的增殖，BMSCs在肝癌新生血管中的比例從7.6%(建模7 d)逐漸升高到19.3%(建模14 d)(P<0.05)。

2.5 肝癌組織中VEGF表達(dá)水平

肝癌組織中VEGF含量高于正常肝組織，見(jiàn)圖3。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),BMSCs動(dòng)員后能分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞而參與血管新生[1，4],VEGF是最主要的骨髓動(dòng)員因子和促血管因子[5]。本實(shí)驗(yàn)顯示,血清VEGF隨著腫瘤生長(zhǎng)明顯升高，BMSCs大量動(dòng)員，肝癌組織中VEGF也明顯高表達(dá)。推測(cè)肝癌組織釋放VEGF入血?jiǎng)訂TBMSCs進(jìn)入循環(huán)，受局部微環(huán)境的趨化而在局部富集，最終在腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)之下分化為成熟的血管內(nèi)皮而參與腫瘤血管新生。有研究認(rèn)為除了直接分化為血管內(nèi)皮外，BMSCs也可在局部分泌促血管生成因子以“旁分泌”方式參與血管新生[6]。

目前對(duì)動(dòng)員后的BMSCs在腫瘤組織中如何分布，觀點(diǎn)不盡相同。有人認(rèn)為腫瘤組織獨(dú)特的缺氧、低pH、高液壓以及高細(xì)胞因子水平對(duì)BMSCs具有顯著的募集作用[7]，但也有人認(rèn)為BMSCs主要在癌旁異常富集[8]。鑒于腫瘤生長(zhǎng)有賴于血管的生成，理論上腫瘤組織應(yīng)該含有更多的BMSCs以促進(jìn)腫瘤血管新生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示動(dòng)員后BMSCs在肝癌組織中富集，定量PCR結(jié)果與其吻合，BMSCs表型基因CD133、CD34在腫瘤中的表達(dá)水平顯著高于無(wú)瘤區(qū)。研究結(jié)果和臨床結(jié)果有差異的可能原因：(1) 動(dòng)物模型沒(méi)有肝硬化背景，而肝硬化常伴有血管新生[9]；(2) 實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤增殖較血管新生活躍；(3) BMSCs分化丟失干細(xì)胞標(biāo)志后不易為臨床檢測(cè)到，而GFP可以有效示蹤BMSCs。某種程度上我們的實(shí)驗(yàn)反映了BMSCs在肝癌組織中的自然分布。

有研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤治療導(dǎo)致血清VEGF以及循環(huán)BMSCs增高[10]。組織酸中毒、低氧、壞死加劇后更多的細(xì)胞因子釋放入血，隨之更多的BMSCs入血。因此盡管腫瘤血管可以被破壞，但是BMSCs釋放入血后可以構(gòu)建新生血管以補(bǔ)償腫瘤血供。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌建模7 d后BMSCs在血管內(nèi)皮中的比率約7.6%，隨著腫瘤的生長(zhǎng)，其比率逐漸達(dá)到19.3%。腫瘤初始階段即需求血管新生為其進(jìn)一步生長(zhǎng)鋪墊，直至形成實(shí)體瘤。事實(shí)上，肝硬化、肝炎、肝癌癌前病變就已經(jīng)發(fā)生了血管新生。當(dāng)形成腫瘤實(shí)體后，血管新生就成為腫瘤明顯的特征同時(shí)也決定了腫瘤的進(jìn)展和患者的預(yù)后。

腫瘤中可見(jiàn)GFPCD31雙陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)，A.紅色，血管內(nèi)皮CD31；B.綠色，GFP標(biāo)記的BMSCs；C和D.藍(lán)色,DAPI染色的細(xì)胞核 ×300，2 μm，F(xiàn)rozen

圖2肝癌組織新生血管中的BMSCs

圖3肝癌組織與正常肝組織中VEGF蛋白電泳圖

我們的研究提示在肝癌生長(zhǎng)過(guò)程中BMSCs在新生血管構(gòu)建中起著重要的作用。循環(huán)BMSCs或許可以作為肝癌重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)，阻斷骨髓介導(dǎo)的血管新生可能在進(jìn)一步提高抗腫瘤新生血管治療效果中起到積極的作用[11]。