柚皮苷通過調(diào)控AKT活化影響人肺癌H1299細(xì)胞增殖、凋亡和遷移

樸雪梅，楊威，金利民，李浩源

(1.吉林省延邊婦幼保健院 藥劑科,吉林 延吉 133001；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科，吉林 長春 130033)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其預(yù)后效果差，肺癌患者的5年生存率只有15%左右，給患者的健康造成了極大的危害[1- 2]。目前，治療肺癌的主要手段是手術(shù)、放療以及化療，但是化療產(chǎn)生的藥物耐受和嚴(yán)重的副作用使應(yīng)用化療藥物治療肺癌受到了很多限制。因此，尋找以及開發(fā)低毒且有效的天然藥物顯得日臻重要。柚皮苷屬于雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科橘柑屬類植物中，是一種次級代謝產(chǎn)物以及天然的苦味劑，其對人體毒副作用比較小[3]。已有研究報道，柚皮苷具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞增殖以及抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[4- 7]。目前，柚皮苷對宮頸癌[8]、卵巢癌[9]、肝癌[10]以及結(jié)腸癌[11]的增殖具有抑制作用，進而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。研究表明，凋亡相關(guān)蛋白Bcl- 2和Bax等活化后進入線粒體，進而促進線粒體膜對細(xì)胞色素C的釋放，這反過來又誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)及其底物的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中，Caspase- 3是一種重要的凋亡執(zhí)行蛋白。正常細(xì)胞的Caspase- 3活性很低，細(xì)胞發(fā)生凋亡后其活性明顯升高[13]。柚皮苷作為一種天然低毒的抗腫瘤化合物，其在肺癌中的作用研究尚缺乏，因此本研究擬探討柚皮苷對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌細(xì)胞H1299購自中科院上海細(xì)胞庫，柚皮苷購自南京澤朗醫(yī)藥公司，RPMI- 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，Annexin V- FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自中國杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，Transwell小室購自北京基尼亞生物技術(shù)有限公司。Bcl- 2抗體以及Bax抗體AKT和p- AKT均購自美國Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購自北京博奧森生物公司，二抗購自武漢博士德生物公司，Caspase- 3活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司。

1.2 H1299細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

復(fù)蘇H1299細(xì)胞后，加入含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。等到細(xì)胞的融合度為90%左右進行細(xì)胞傳代。細(xì)胞分為對照組(NC)、10 μmol·L-1柚皮苷處理組、20 μmol·L-1柚皮苷處理組和40 μmol·L-1柚皮苷處理組。

1.3 MTT法檢測定細(xì)胞增殖

取生長狀態(tài)良好的H1299細(xì)胞，以每孔1 000個細(xì)胞的密度均勻接種到96孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。等到細(xì)胞貼壁后用不同濃度的柚皮苷處理細(xì)胞24、48、72 h。每組設(shè)置6個復(fù)孔。藥物作用終止前4 h向每孔中加入20 μl MTT(5 mg·ml-1)繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后用移液槍吸棄MTT，加入體積為150 μl的DMSO，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，在波長為490 nm的條件下用酶標(biāo)儀讀取每孔的吸光度值(OD值)。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取生長狀態(tài)良好的H1299細(xì)胞，以每孔3×105個的細(xì)胞密度均勻接種于6孔板中。等到細(xì)胞貼壁后用不同濃度的柚皮苷處理細(xì)胞，繼續(xù)孵育24 h后，用PBS洗滌2次，1 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞。用Binding buffer(500 μl)對細(xì)胞進行重懸后加入Annexin V- FITC(5 μl)和PI(10 μl)充分混勻，避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.5 Western blotting法檢測Bcl- 2、Bax蛋白的表達(dá)

用不同濃度的柚皮苷處理細(xì)胞24 h后，按照試劑說明書對各組細(xì)胞的蛋白進行提取。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，配置濃度為12%的分離膠，經(jīng)聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝膠電泳。電泳結(jié)束后進行濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，電流大小恒為250 mA，時間為120 min。然后用5%脫脂牛奶對PVDF膜進行封閉。封閉結(jié)束后于4 ℃條件下，用一抗稀釋液(anti- Bcl- 2,1∶1 000;anti- Bax,1∶1 000;anti- p- AKT,1∶1 000;anti- AKT,1∶1 000;anti- GAPDH,1∶1 000)對PVDF膜進行過夜孵育。用TBST洗滌PVDF膜3次(10 min·次-1)，在搖床上進行洗滌。室溫孵育二抗，孵育60 min后用TBST洗滌PVDF膜3次(10 min·次-1)，在搖床上進行洗滌。最后用成像儀顯影。用GAPDH作為內(nèi)參，比較分析各組目的蛋白表達(dá)水平的差異。

1.6 比色皿法檢測H1299細(xì)胞中Caspase- 3活性

取生長狀態(tài)良好的H1299細(xì)胞，以每孔3×105個的細(xì)胞密度均勻接種于6孔板中，放于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。等到細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的柚皮苷處理細(xì)胞，繼續(xù)孵育24 h。去除上清，每孔加入100 μl預(yù)冷的裂解液，放置于冰上裂解15 min。然后，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清。參照Caspase- 3活性檢測試劑盒的說明書進行操作，檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase- 3蛋白活性。最后，在波長為405 nm的條件下，用酶標(biāo)儀讀取OD值，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出Caspase- 3活性，設(shè)對照組Caspase- 3活性為1。

1.7 細(xì)胞遷移實驗

將不同濃度柚皮苷處理24 h的各細(xì)胞懸液 200 μl (細(xì)胞接種密度為1×105個·ml-1)分別加入到上室中，并用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室則加入體積為500 μl含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液。放置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育。24 h后取出小室并移去上室內(nèi)培養(yǎng)液。用棉棒輕輕擦去小室膜表面未穿過的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。PBS洗滌后再用1%結(jié)晶紫染色液染色，PBS洗滌后用倒置顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野進行拍照，計算發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究的實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，10、20和40 μmol·L-1的柚皮苷處理H1299細(xì)胞后，其細(xì)胞活力顯著降低，且呈劑量和時間依賴性，見表1。

2.2 柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V- FITC/PI雙染流式結(jié)果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理H1299細(xì)胞24 h可明顯增加細(xì)胞的凋亡率，見圖1。

2.3 柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞Bcl- 2、Bax蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h可顯著降低H1299細(xì)胞內(nèi)Bcl- 2蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖2。

組 別 OD值24 h48 h72 h空白對照組0.524±0.0250.703±0.0430.889±0.03110 μmol·L-1柚皮苷處理組0.375±0.016a0.425±0.027a0.513±0.053a20 μmol·L-1柚皮苷處理組0.267±0.022a0.284±0.009a0.265±0.068a40 μmol·L-1柚皮苷處理組0.195±0.065a0.137±0.025a0.109±0.046a

與對照組比較，aP<0.05

2.4 柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞Caspase- 3活性的影響

柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h可顯著增加H1299細(xì)胞Caspase- 3活性，且隨著柚皮苷濃度的增加而增加。見表2。

2.5 柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞遷移的影響

Transwell結(jié)果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h可顯著抑制H1299細(xì)胞的遷移，且這種抑制作用具有濃度依賴性。見圖3。

2.6 柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞AKT活化的影響

濃度為10、20、40 μmol·L-1的柚皮苷處理細(xì)胞24 h后，H1299細(xì)胞的p- AKT/AKT水平顯著降低，表明柚皮苷抑制肺癌H1299細(xì)胞AKT的活化。見圖4。

3 討 論

柚皮苷屬于天然黃酮類化合物，許多研究已證實柚皮苷具有抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤效應(yīng)[14,9]。研究進一步發(fā)現(xiàn)，柚皮苷的抗腫瘤作用與它的苯環(huán)取代基相關(guān)，其中位于A酚環(huán)上的糖結(jié)合物的種類發(fā)揮重要作用，B環(huán)上連有羥基也同樣表現(xiàn)出很強的抗腫瘤效應(yīng)，例如羥基連在B環(huán)上3、4和5的位置或者B環(huán)有飽和的C環(huán)和一鄰位酚結(jié)構(gòu)就會表現(xiàn)出極強的抗腫瘤生物活性[15]。研究資料顯示，柚皮苷主要通過抑制癌細(xì)胞的增殖、促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡、抑制癌基因的表達(dá)等產(chǎn)生抗腫瘤作用[16]。黃酮類的抗細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用受到了廣大學(xué)者的關(guān)注，很多學(xué)者對有關(guān)柚皮苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞發(fā)生癌變的物理和化學(xué)因子進行了一系列研究[17- 18]。Camargo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的柚皮苷可對大鼠W256癌肉瘤的生長產(chǎn)生抑制作用。但是，目前柚皮苷在肺癌中的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷可明顯抑制肺癌H1299細(xì)胞的增殖，隨著柚皮苷作用濃度的增加和處理時間的延長，這種抑制作用越來越強。這表明柚皮苷可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖，且呈濃度和時間依賴關(guān)系。

圖1不同濃度柚皮苷對H1299細(xì)胞凋亡率的影響

與對照組比較，aP<0.05, bP<0.01

圖2不同濃度柚皮苷對H1299細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

組 別Caspase-3活性空白對照組1.01±0.0210 μmol·L-1柚皮苷處理組1.57±0.08a20 μmol·L-1柚皮苷處理組2.23±0.05a40 μmol·L-1柚皮苷處理組2.69±0.07a

與對照組比較,aP<0.05

與對照組比較，aP<0.05

圖3不同濃度柚皮苷對H1299細(xì)胞遷移的影響

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是抗癌藥物發(fā)揮效應(yīng)的重要途徑。AnnexinV- FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示，柚皮苷能增加肺癌H1299細(xì)胞的凋亡率，且呈劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是受到很多相關(guān)基因調(diào)控的，如Bcl- 2家族在其中發(fā)揮重要功能。Bcl- 2是首個被發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，它主要位線粒體核膜和外膜等，可通過抑制細(xì)胞色素C等促凋亡分子的釋放，保持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定，減弱自由基的堆積，抑制染色質(zhì)發(fā)生濃縮和裂解，進而抑制凋亡的發(fā)生[20]。此外，Bcl- 2能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，并阻止它的合成。Bax作為Bcl- 2的同源性蛋白，可發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡的功能。它能夠改變線粒體的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，進而啟動Caspase相關(guān)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。我們的研究結(jié)果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl- 2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Caspase是凋亡過程的核心因子，活化的Caspase- 3能夠特異性切割不同底物，對細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)進行降解，最終誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[13]。于是，我們進一步探討了柚皮苷對肺癌H1299細(xì)胞Caspase- 3活性的影響。結(jié)果顯示，柚皮苷處理可明顯增加肺癌H1299細(xì)胞Caspase- 3的活性，且隨著柚皮苷濃度的增加而增加。以上結(jié)果表明，柚皮苷誘導(dǎo)H1299細(xì)胞凋亡可能是通過影響B(tài)cl- 2、Bax蛋白表達(dá)水平以及Caspase- 3活性實現(xiàn)的。

與對照組比較，aP<0.05

圖4不同濃度柚皮苷對H1299細(xì)胞AKT活化的影響

研究表明，細(xì)胞遷移與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22- 24]。本研究還進一步探討了柚皮苷對人肺癌H1299細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell結(jié)果顯示，柚皮苷可濃度依賴性地抑制H1299細(xì)胞的遷移。研究報道，AKT活化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[25]。同樣，AKT活化也與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[26]。因此，本研究探也討了柚皮苷對人肺癌H1299細(xì)胞AKT活化的影響。結(jié)果顯示，柚皮苷處理H1299細(xì)胞后，其p- AKT/AKT水平顯著降低，表明柚皮苷可抑制肺癌H1299細(xì)胞AKT的活化。

本研究結(jié)果表明，柚皮苷對人肺癌細(xì)胞的增殖和遷移具有抑制作用，其機制可能與其抑制AKT的活化有關(guān)，本研究的發(fā)現(xiàn)可為柚皮苷體外抗腫瘤機制的研究提供理論依據(jù)。