無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)對腦缺血再灌注大鼠存活素和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

魯慧，王彬成，崔寧寧，張艷春，楊蘭

(1.滄州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 滄州 061000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 053600)

缺血性腦血管疾病致殘率和致死率比較高，是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，腦血管疾病的發(fā)病年齡趨向年輕化，對患者的心理和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，因此降低腦梗死的發(fā)病率以及減輕腦梗死后腦損傷具有重要意義[1]。腦血管疾病常用的治療方法主要為手術(shù)治療、藥物治療、介入治療等[2]，這些方法的特點為采用外來的、被動的手段作用于機(jī)體，沒有發(fā)揮和調(diào)動機(jī)體的主動抗病能力。肢體缺血預(yù)適應(yīng)對遠(yuǎn)端的心臟、腦、肝臟等組織器官具有保護(hù)作用[3]。存活素在抑制細(xì)胞凋亡方面具有重要作用[4]，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有比較強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的作用[5]，存活素和VEGF在缺血性腦損傷中具有重要作用。本研究對腦缺血再灌注大鼠進(jìn)行無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)，觀察其對腦梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF表達(dá)的影響，探討無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)對腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康清潔級8周齡雄性SD大鼠90只,購自北京醫(yī)療器械檢驗所，許可證號SYXK為(京)2015-0006。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠存活素多克隆抗體、VEGF多克隆抗體和β- actin(美國Sigma公司)，免疫組化二步法檢測試劑盒(中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 建立腦缺血再灌注模型 大鼠水合氯醛麻醉成功后，取正中切口暴露大鼠左側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端和頸總動脈近心端，在頸外動脈結(jié)扎處近心端剪開一小口，將栓線插入頸內(nèi)動脈栓塞左側(cè)大腦中動脈，栓線長度18～20 mm，缺血1 h后抽出栓線形成再灌注，再灌注24 h。腦缺血再灌注成功的標(biāo)志：大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，包括右下肢伸直、站立不穩(wěn)、右上肢癱瘓、提尾時右前肢內(nèi)收、右肩內(nèi)旋、雙前肢肌張力和抓力不等等癥狀。

1.3.2 建立無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)大鼠模型 大鼠水合氯醛麻醉成功后，在左后肢根部用動物無創(chuàng)血壓測試儀自制套管套住，將脈搏傳感器緊貼在足背動脈上連續(xù)監(jiān)測脈搏和血壓。加壓阻斷股動脈，股動脈阻斷的標(biāo)志為脈搏消失、皮膚發(fā)紺、肢體遠(yuǎn)端體溫下降，股動脈阻斷5 min，減壓再灌注，再灌注的標(biāo)志為脈搏出現(xiàn)、皮膚潮紅、體溫回升，再灌注5 min，共3個循環(huán)。

1.3.3 動物分組和處理 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法將90只大鼠分為假手術(shù)組(sham組)、腦缺血再灌注損傷組(I/R組)、腦缺血再灌注損傷+無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(I/R+NDLIP組)，每組30只，10只用于腦梗死范圍測定，10只用于梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞測定，10只用于梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF蛋白的測定。Sham組大鼠游離左側(cè)頸總動脈但不夾閉；I/R組腦缺血1 h、再灌注24 h；I/R+NDLIP組左后肢缺血5 min、再灌注5 min共3個循環(huán)，每天1次，連續(xù)3 d，第4天腦缺血1 h、再灌注24 h。

1.3.4 大鼠神經(jīng)缺損癥狀和行為評分測定 大鼠缺血1 h、再灌注24 h后觀察神經(jīng)缺損癥狀并進(jìn)行行為評分：(1) 提起鼠尾，如果雙前肢對稱伸向地面為0分；如果右側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲為1分、肘屈曲為2分、肩內(nèi)旋為3分，既有腕肘屈曲又有肩內(nèi)旋為4分；(2) 將大鼠置于平滑地面上推雙肩向?qū)?cè)移動，雙側(cè)阻力對稱為0分，左肩向右側(cè)移動阻力下降者，根據(jù)阻力下降程度分為1～3分；(3) 將大鼠雙前肢置金屬網(wǎng)上，兩前肢肌張力對稱為0分，右側(cè)前肢肌張力下降者，根據(jù)肌張力下降程度分為1～3分；(4) 大鼠不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者為1分?？偡?1分，分值越高神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.3.5 腦梗死范圍測定 缺血1 h、再灌注24 h后斷頭處死大鼠，取出腦組織，剔除小腦、低位腦干、嗅腦，沿冠狀面切4刀將腦組織切成5片，置于含K2HPO4和TTC溶液中孵育30 min，正常腦組織被染色為玫瑰紅色，腦梗死區(qū)被染色為白色。將腦組織置于福爾馬林中固定24 h，取出稱取腦組織總濕重，刀片剔下腦梗死組織，稱取腦梗死組織濕重，腦梗死范圍為腦梗死組織濕重/腦組織總濕重×100%。

1.3.6 各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞測定 缺血1 h、再灌注24 h后斷頭處死大鼠，取出腦組織，經(jīng)多聚甲醛固定，取前囟前1 mm至前囟后2 mm之間腦組織，切塊、沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后取冠狀腦組織切片，采用免疫組化二步法進(jìn)行免疫組化染色，腦組織皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞呈棕黃色，取梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)5個視野，高倍鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.3.7 各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF蛋白表達(dá)量測定 缺血1 h、再灌注24 h后斷頭處死大鼠，取出腦組織，取右側(cè)大腦半球缺血半暗區(qū)皮質(zhì)腦組織勻漿后去上清，提取總蛋白，采用Western blotting法測定存活素和VEGF蛋白表達(dá)，一抗為兔抗大鼠存活素、VEGF多克隆抗體，以β- actin為內(nèi)參照，存活素、VEGF蛋白的相對表達(dá)量=存活素、VEGF條帶灰度值/β- actin條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)缺損癥狀和行為評分情況

sham組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，I/R組和I/R+NDLIP組均出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，神經(jīng)缺損癥狀主要表現(xiàn)為提尾懸空時右側(cè)前肢肌張力下降、肩部內(nèi)旋、前肢內(nèi)收。I/R組神經(jīng)缺損癥狀和行為評分明顯升高，I/R+NDLIP組大鼠神經(jīng)缺損癥狀和行為評分低于I/R組(t=5.588，P=0.000)。見表1。

表1各組大鼠神經(jīng)缺損癥狀和行為評分

組 別神經(jīng)缺損癥狀和行為評分sham組0I/R組9.73±0.98I/R+NDLIP組5.90±0.71

2.2 各組大鼠腦梗死范圍

sham組大鼠未見腦梗死區(qū)域，I/R組和I/R+NDLIP組大鼠均見腦梗死區(qū)域，經(jīng)TTC染色后，腦梗死區(qū)呈白色，正常腦組織呈紅色。I/R+NDLIP組大鼠腦梗死范圍明顯低于I/R組(t=6.748，P=0.000)。見表2。

表2各組大鼠腦梗死范圍

組 別腦梗死范圍/%sham組0I/R組16.26±3.18I/R+NDLIP組10.75±1.39

2.3 各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞比較

I/R組和I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞均高于sham組(P<0.05)，I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞均高于I/R組(P<0.05)。見表3、圖1。

2.4 各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF蛋白相對表達(dá)量比較

I/R組和I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF蛋白相對表達(dá)量均高于sham組(P<0.05)，I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF蛋白相對表達(dá)量均高于I/R組(P<0.05)。見表4。

表3各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞比較

組 別n存活素陽性細(xì)胞/個·HP-1VEGF陽性細(xì)胞/個·HP-1Sham組103.49±0.374.10±0.38I/R組1031.30±2.25a36.35±1.84aI/R+NDLIP組1038.65±3.26ab44.56±2.08abt值6.4311.359P值0.0000.000

與sham組比較，aP<0.05，與I/R組比較，bP<0.05

表4各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF蛋白相對表達(dá)量比較

組 別n存活素蛋白相對表達(dá)量VEGF蛋白相對表達(dá)量Sham組100.44±0.020.53±0.02I/R組101.19±0.05a1.03±0.08aI/R+NDLIP組101.57±0.07ab1.43±0.06abt值12.9205.413P值0.0000.000

與sham組比較，aP<0.05，與I/R組比較，bP<0.05

圖1各組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞(×400)

3 討 論

遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)是指對骨骼肌、小腸、腎臟等組織的缺血預(yù)處理可減輕局部器官或組織隨后的缺血再灌注損傷，對心臟、腦、腎、肝臟、胰腺等遠(yuǎn)端組織器官也有保護(hù)作用[6- 7]。遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)可通過對機(jī)體不太重要的器官組織的缺血預(yù)適應(yīng)來保護(hù)心臟、腦等重要器官[8- 9]；小腸和腎臟的缺血預(yù)處理均需要手術(shù)完成，為有創(chuàng)性操作[10]，且小腸和腎臟對缺血損傷比較敏感，反復(fù)短時間的血供阻斷和恢復(fù)有可能對小腸和腎臟造成損傷；骨骼肌的缺血預(yù)適應(yīng)可采用捆綁止血帶的無創(chuàng)方法進(jìn)行血流阻斷，且骨骼肌對缺血的耐受性比較強(qiáng)，引起肢體缺血預(yù)適應(yīng)可行性強(qiáng)、操作簡單，使其在臨床上具有巨大的應(yīng)用潛能[11- 13]。本研究對腦缺血再灌注大鼠進(jìn)行無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：sham組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀、未見腦梗死區(qū)域，I/R組和I/R+NDLIP組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀、見腦梗死區(qū)。I/R+NDLIP組大鼠神經(jīng)缺損癥狀和行為評分、腦梗死范圍低于I/R組?？梢姡瑹o創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)可減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)缺損癥狀及腦梗死面積，對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

存活素是強(qiáng)大的凋亡抑制蛋白，可通過與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子結(jié)合阻斷凋亡信號、阻止細(xì)胞色素C釋放、抑制半胱氨酸蛋白酶活化等機(jī)制發(fā)揮抑制凋亡的作用；存活素還具有促進(jìn)血管生成的作用，其機(jī)制可能為存活素可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮生長因子等參與血管形成[14]。存活素在正常成熟組織中無表達(dá)或低表達(dá)，在腫瘤組織中呈強(qiáng)表達(dá)，在受損的腦組織中也呈高表達(dá)[15- 16]。VEGF具有顯著的促進(jìn)血管生成的作用，對循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能和發(fā)育具有重要作用；VEGF可選擇性地與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)血管生成[17- 18]；VEGF為作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性和活性最強(qiáng)的關(guān)鍵性因子，對缺血性腦血管疾病具有重要的保護(hù)作用[19]。本研究對腦缺血再灌注大鼠進(jìn)行無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)，觀察其對大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：I/R組和I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞和蛋白表達(dá)量均高于sham組，I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF陽性細(xì)胞和蛋白表達(dá)量均高于I/R組?？梢姡X缺血再灌注大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF表達(dá)增加，存活素和VEGF對腦缺血再灌注大鼠具有腦保護(hù)作用，存活素可能通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用；VEGF對腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用可能與VEGF促進(jìn)血管新生有關(guān)，通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用。無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)可進(jìn)一步提高大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF表達(dá)，其對腦缺血再灌注大鼠腦組織的保護(hù)作用可能與其上調(diào)大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)存活素和VEGF表達(dá)有關(guān)。