壇紫菜多酚提取工藝及體外抗氧化與抑菌活性研究

陳洪彬 宋露露 金瑾萱 程永強

(1. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362002；2. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)與功能開發(fā)重點實驗室， 福建 泉州 362002；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

壇紫菜(Porphyrahaitanensis)又名紫菜、烏菜，是中國浙江、福建和廣東沿海主要養(yǎng)殖的大型藻類[1]。根據(jù)2016年中國漁業(yè)統(tǒng)計分析，2015年中國養(yǎng)殖紫菜約1.16×105t，其中福建養(yǎng)殖約5.3×104t，占中國總產(chǎn)量近50%[2]，但每年用于鮮食或加工的均為前2～3次收割的紫菜，末水殘次壇紫菜基本被廢棄，占總量10%以上。壇紫菜富含膳食纖維和蛋白質(zhì)，營養(yǎng)和藥用價值極高，提取低值壇紫菜中的有效活性成分可以提高其附加值，減少資源浪費和環(huán)境污染，為紫菜深加工拓寬新渠道。

海藻多酚主要是海藻植物中的間苯三酚衍生物或其聚合物，具有抗氧化、抑菌、增強機體免疫等多種生理活性[3-4]。福建的紫菜資源豐富，有關(guān)紫菜有效活性成分的研究主要集中在多糖[5-7]、多肽[8-9]方面，有關(guān)多酚類的研究還處在起步階段。Kazowska等[10]研究表明，紫菜多酚通過提高巨噬細(xì)胞中一氧化氮的含量來抵抗體外炎癥的發(fā)生。李鋒等[11]對壇紫菜多酚進行分離純化，發(fā)現(xiàn)壇紫菜多酚除了具有較強的體外抗氧化能力，還可以抑制皮膚表皮的紫外線傷害。也有研究[12]發(fā)現(xiàn)，紫菜多酚提取物能顯著抑制中國對蝦冷藏過程中微生物的增殖作用，保持較好的冷藏對蝦品質(zhì)。李穎暢等[13]和鐘明杰等[14]分別采用超聲波和微波輔助提取紫菜多酚，可以較好地提高紫菜多酚的提取率。超聲波輔助提取法因其機械效應(yīng)和熱效應(yīng)，具有高提取率、低能量和可有效保護活性成分的生理作用等優(yōu)勢，在活性物質(zhì)提取方面被廣泛應(yīng)用[13,15]。目前，有關(guān)超聲波輔助提取壇紫菜多酚研究較少，對壇紫菜多酚的體外抗氧化活性評價以清除DPPH自由基和羥基自由基能力為主[11,14,16]，方式較為單一，而有關(guān)壇紫菜多酚的抑菌活性評價鮮見報道。本試驗以福建養(yǎng)殖的壇紫菜為原料，利用超聲波輔助提取壇紫菜多酚，在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，考察液料比、超聲時間和乙醇濃度對壇紫菜多酚含量的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化壇紫菜多酚的提取工藝參數(shù)；采用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及氧自由基吸收能力(ORAC)來系統(tǒng)評價壇紫菜多酚體外抗氧化活性，采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和藤黃八疊球菌來系統(tǒng)評價其體外抑菌活性，為壇紫菜多酚的利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

壇紫菜：石獅古浮四水壇紫菜，烘干粉碎至80目，備用(含水量為4.58%±0.11%)；

多功能酶標(biāo)儀：Infinite 200 PRO型，瑞士帝肯集團公司；

紫外可見分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

分析天平：CP224C型，奧豪斯儀器上海有限公司;

萬能粉碎機：ZN-02型，北京興時利儀器有限公司；

高速冷凍離心機：GL-20G-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

全自動菌落計數(shù)儀：SupcreG6R型，杭州迅數(shù)科技有限公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9050型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

雙頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超聲儀器有限公司；

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：分析純，美國西格瑪奧德里奇公司；

FL熒光素鈉、AAPH、Trolox、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀等：分析純，德國克雷貝爾公司；

沒食子酸、福林酚、無水碳酸鈉、無水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 壇紫菜多酚提取工藝

壇紫菜→粉碎→過篩(80目)→超聲輔助提取→離心(8 000 r/min，30 min)→壇紫菜多酚提取液

1.2.2 多酚含量的測定 參考陳洪彬等[15]的方法，以沒食子酸計，用mg GAE/g表示(烘干后粉末重量)。

1.2.3 壇紫菜多酚體外抗氧化活性和抑菌活性的測定

(1) DPPH自由基清除率：參照文獻[15]。

(2) ABTS自由基清除率：參照文獻[17]。

(3) 氧自由基吸收能力：參照文獻[18]。

(4)IC50值：參照文獻[15]。

(5) 抑菌效果：采用打孔法評價，用自動菌落計數(shù)聯(lián)用儀記錄抑菌圈的直徑。

1.2.4 單因素和響應(yīng)面試驗設(shè)計

(1) 液料比：在超聲時間40 min、乙醇濃度60%的條件下，分別考察不同液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1(mL/g)] 對壇紫菜多酚含量的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(2) 超聲時間：在液料比30∶1 (mL/g)、乙醇濃度60%的條件下，分別考察不同超聲時間(10，20，30，40，50 min)對壇紫菜多酚含量的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(3) 乙醇濃度：在液料比30∶1 (mL/g)、超聲時間40 min 的條件下，分別考察不同乙醇濃度(20%，40%，60%，80%，100%)對壇紫菜多酚含量的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(4) 響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液料比、超聲時間、乙醇濃度為試驗因素，以壇紫菜多酚含量為評價指標(biāo)，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗優(yōu)化壇紫菜多酚超聲波輔助法提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比 由圖1可知，隨著液料比的增加，壇紫菜多酚含量呈先升高后降低的趨勢。在液料比為30∶1 (mL/g)時，壇紫菜多酚含量最高，為(6.80±0.04) mg GAE/g，之后壇紫菜多酚含量有所下降。這是因為液料比過低不利于壇紫菜多酚的溶出，而較高的液料比將溶出更多雜質(zhì)，影響多酚的溶出，同時也增加后續(xù)濃縮成本。本研究多酚含量的變化趨勢與李穎暢等[13]的研究結(jié)果類似。因此，選擇液料比為30∶1 (mL/g)。

2.1.2 超聲時間 由圖2可知，隨著超聲時間的延長，壇紫

圖1 液料比對壇紫菜多酚含量的影響

Figure 1 Effects of liquid-material ratio on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

菜多酚含量升高。在超聲10～30 min時，壇紫菜多酚含量增加快速，之后緩慢升高，到超聲40 min時，壇紫菜多酚含量達到最大值，之后趨于穩(wěn)定。這是因為超聲達到一定時間后，壇紫菜多酚已基本溶出，再延長超聲時間，已經(jīng)無法再有多酚溶出。該多酚含量的變化趨勢與陳洪彬等[15]的類似。因此，選擇超聲時間為40 min。

圖2 超聲時間對壇紫菜多酚含量的影響

Figure 2 Effects of ultrasonic times on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

2.1.3 乙醇濃度 由圖3可知，乙醇濃度對壇紫菜多酚含量的影響較大。隨著乙醇濃度增加，壇紫菜多酚含量整體呈先升高后下降的趨勢。乙醇濃度在20%～60%時，超聲輔助提取的壇紫菜多酚含量快速升高，乙醇濃度在60%時，壇紫菜多酚含量達到最大值，為(6.81±0.06) mg GAE/g，之后壇紫菜多酚含量快速下降，當(dāng)乙醇濃度達到100%時，壇紫菜僅有少量多酚被超聲浸出。這可能是海藻中的多酚類物質(zhì)以間苯三酚及其衍生物為主[3]，水溶性較高，過高的乙醇濃度不利于多酚物質(zhì)的溶出。因此，選擇乙醇濃度為60%。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以壇紫菜多酚含量作為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Benhnken 中心組合原理進行響應(yīng)面設(shè)計，試驗因素水平表見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

圖3 乙醇濃度對壇紫菜多酚含量的影響

Figure 3 Effects of ethanol concentration on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

表1 因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 壇紫菜多酚提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

利用Design-Expert 8.05軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析，得到以壇紫菜多酚含量(Y)為響應(yīng)值的回歸方程：

Y=6.71+0.26A+0.39B+0.51C+0.04AB-0.29AC-0.30BC-0.18A2-0.52B2-0.47C2。

(1)

對各項方差的進一步分析可知，3個因素對壇紫菜多酚含量的影響順序為：乙醇濃度>超聲時間>料液比。其中，B、C、B2和C2項對壇紫菜多酚含量的影響達到極顯著水平，A、AC和BC項達到顯著水平。在α=0.05顯著水平下將不顯著項進行剔除，得到優(yōu)化后的回歸方程：

Y=6.63+0.26A+0.39B+0.51C-0.29AC-0.30BC-0.53B2-0.48C2。

(2)表3 方差分析?Table 3 ANOVA of the constructed regression model

2.2.2 試驗因素間的交互作用 對表3進一步分析，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度與液料比、超聲時間的交互項對壇紫菜多酚含量的影響達到顯著水平(P<0.05)，其中乙醇濃度與超聲時間之間對壇紫菜多酚含量的交互影響最大。為更直觀說明交互影響作用，對交互項作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。由圖4可以看出，乙醇濃度和超聲時間之間的響應(yīng)面曲面坡度陡峭，等高線圖呈扁平橢圓狀，說明乙醇濃度和超聲時間之間具有較強的交互作用，對壇紫菜多酚含量的影響大。

2.2.3 最佳工藝參數(shù) 進一步分析響應(yīng)面分析回歸方程，得到壇紫菜多酚提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：液料比35.06∶1 (mL/g)、超聲時間43.08 min、乙醇濃度65.86%，此時超聲輔助提取壇紫菜多酚的理論含量為6.91 mg GAE/g。為檢驗響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，對最優(yōu)工藝參數(shù)進行驗證實驗(n=3)，根據(jù)實際操作情況，將驗證條件修正為液料比35∶1(mL/g)、超聲時間43 min、乙醇濃度66%，此時提取的壇紫菜多酚含量為(6.85±0.13) mg GAE/g。

2.2.4 體外抗氧化和抑菌活性評價 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化工藝結(jié)果，制備壇紫菜多酚，采用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及氧自由基吸收能力(ORAC)評價該壇紫菜多酚的體外抗氧化活性，以抗壞血酸為陽性對照，結(jié)果見表4和圖5。由表4可知，壇紫菜多酚具有一定的抗氧化活性，其多酚含量與DPPH自由基、ABTS自由基清除率呈線性正相關(guān)性。壇紫菜多酚的DPPH自由基清除率IC50值為(36.54±0.75) μg/mL，是陽性對照抗壞血酸的2.33倍，說明它的體外抗氧化效果低于同濃度下的抗壞血酸；壇紫菜多酚的ABTS自由基清除率IC50值為(16.07±0.32) μg/mL，略弱于同濃度下抗壞血酸的[抗壞血酸ABTS自由基IC50值為(11.96±0.26) μg/mL]。根據(jù)圖5，按文獻[17]的計算方法，得到壇紫菜多酚的氧自由基吸收能力值為(1 005.1±11.8) μmol TE/g，說明壇紫菜多酚具有較高的抗氧化能力。

圖4 乙醇濃度和超聲時間對壇紫菜多酚含量的交互影響Figure 4 Interaction effects of ethanol concentration and ultrasonic times on the contents of polyphenols from Porphyra haitanensis表4 壇紫菜多酚和抗壞血酸的DPPH自由基、ABTS自由基清除率IC50值Table 4 IC50 values for DPPH free radical, ABTS free radical of polyphenols from Porphyra haitanensis and ascorbic acid

評價指標(biāo)評價對象回歸方程R2IC50/(μg·mL-1)DPPH自由基壇紫菜多酚y=0.898 6 x+17.1090.990 636.54±0.75抗壞血酸 y=2.157 7 x+16.0730.995 215.71±0.18ABTS自由基壇紫菜多酚y=2.783 5 x+5.322 80.991 616.07±0.32抗壞血酸 y=3.604 6 x+6.933 40.996 311.96±0.26

圖5 紫菜粗多酚和水溶性VE溶液熒光衰減曲線

Figure 5 The attenuation curve of fluorescence intensity ofPorphyrahaitanensispolyphenol and trolox

由表5可知，不同濃度的壇紫菜多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和藤黃八疊球菌的抑菌效果不同，隨著壇紫菜多酚濃度的增加，其抑菌圈直徑逐漸增大，對不同微生物的抑制效果也隨之提高。進一步分析可知，壇紫菜多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和藤黃八疊球菌的最小抑菌濃度分別為1，1，1，2 mg/mL。因此認(rèn)為，壇紫菜多酚具有一定抑菌活性。

3 結(jié)論

本研究利用超聲波輔助提取四水壇紫菜中的多酚，以多酚含量為評價指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面試驗確定壇紫菜多酚最佳提取工藝條件為液料比35∶1 (mL/g)、超聲時間43 min、乙醇濃度66%，在此條件下，壇紫菜多酚含量為(6.85±0.13) mg GAE/g，與鐘明杰等[14]采用微波輔助提取的紫菜多酚相比含量要高，可能是微波輻射破壞多酚的結(jié)構(gòu)。同時，本研究結(jié)果與李穎暢等[13]采用超聲波輔助提取的紫菜多酚含量基本一致，說明利用超聲波輔助提取紫菜多酚的方法可靠，為低值壇紫菜制備多酚的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)。通過體外抗氧化和抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)壇紫菜多酚具有較強的抗氧化活性和抑菌活性，是一種潛在的天然抗氧化和抑菌物質(zhì)，但有關(guān)它的抗氧化、抑菌活性及其他生物活性和構(gòu)效關(guān)系有待進一步深入研究。

表5 不同濃度壇紫菜多酚的體外抑菌效果?Table 5 Bacteriostasis effects of different concentrations of polyphenols from Porphyra haitanensis in vitro

? 牛津杯內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm。