美拉德糖基化對(duì)玉米蛋白粉雙酶水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

劉 祥 鄭喜群 劉曉蘭

(1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾市 161006； 2. 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米蛋白粉(corn gluten meal)是玉米濕法生產(chǎn)淀粉過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，因?yàn)槭杷园被岷扛?，水溶性差，加工性能不好，人體消化吸收利用率低等因素的影響，限制了其在食品加工中的應(yīng)用。與其他谷物蛋白相比，玉米蛋白粉的多肽鏈中含有抗氧化、抗高血壓和促進(jìn)酒精代謝等功能序列區(qū)[1]，使用合適的蛋白酶處理可以很好地將這些功能序列釋放出來(lái)，使玉米蛋白粉成為優(yōu)良的功能食品原料。本課題組[2]曾利用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶協(xié)同作用玉米蛋白粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物的·OH清除率、DPPH·清除率和Fe2+螯合能力均較高。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是改變細(xì)胞生物活性的關(guān)鍵一步，因?yàn)樗梢哉{(diào)節(jié)分子間的相互作用，如蛋白質(zhì)和多肽[3]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能以糖基化、磷酸化、甲基化等方式出現(xiàn)，而蛋白質(zhì)的糖基化被認(rèn)為是細(xì)胞中重要的翻譯后修飾[4]。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)糖基化后會(huì)產(chǎn)生許多具有特性功能的糖蛋白，這些糖蛋白在生物體內(nèi)起到了調(diào)控生命體正?；顒?dòng)的作用，例如生物體的免疫調(diào)節(jié)功能、抗氧化功能和抗疲勞能力都與之有著密切聯(lián)系[5]。

蛋白質(zhì)美拉德糖基化是蛋白質(zhì)、短肽和氨基酸與還原糖之間的一種非酶褐變反應(yīng)[6]。食品加工過(guò)程中，它的反應(yīng)產(chǎn)物可以影響到食品的風(fēng)味和色澤[7]。在一些體外試驗(yàn)研究[8-9]中，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物表現(xiàn)出了抗氧化、抗高血壓和抑菌的生物活性，Marko等[10]研究還發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。

殼寡糖是自然界中唯一呈堿性、帶正電、相對(duì)分子質(zhì)量在2 000以內(nèi)、水溶性、動(dòng)物性纖維寡糖，被譽(yù)為是人體的第六生命要素。殼寡糖不僅有提高機(jī)體的免疫能力、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)化學(xué)性肝損傷等功能，因具有甜味，還可以作為添加劑改善食品風(fēng)味[11]。

本研究擬通過(guò)美拉德糖基化改性技術(shù)，對(duì)雙酶水解玉米蛋白粉的水解產(chǎn)物進(jìn)行蛋白改性，并研究酶解產(chǎn)物和其美拉德糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米蛋白粉：黑龍江龍鳳玉米開(kāi)發(fā)有限公司；

α-淀粉酶：酶活2.0×105U/g，食品級(jí)，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

堿性蛋白酶：(酶活2.1×105U/g)、復(fù)合蛋白酶(酶活2.3×104U/g)：食品級(jí)，丹麥諾維信公司；

殼寡糖：分子量為≤1 kDa，脫乙酰度為95%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司；

DPPH：純度≥95%，美國(guó)Sigma公司；

其他化學(xué)試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器和設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

pH計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：PC/PLC-LD-53型，美國(guó)MILLROCK公司；

蛋白質(zhì)色譜儀：Purifier 100型，美國(guó)GE公司；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-1型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)：TCL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 玉米蛋白水解產(chǎn)物(CGH)的制備

精確稱取一定量的玉米蛋白粉，用50 mmol/L pH 7.0的Tirs-HCl緩沖液配成濃度為10%的蛋白懸液，先后用復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行水解。復(fù)合蛋白酶加酶量為2.5 g/100 g·底物，水解(溫度50 ℃，pH 7.0)3 h后立即用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至8.5，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶加酶量為2.5 g/100 g·底物，水解(溫度65 ℃，pH 8.5) 2.5 h。水解過(guò)程中使用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH(復(fù)合蛋白酶為7.0，堿性蛋白酶為8.5)恒定，水解5.5 h 后于沸水中滅酶15 min，于3 000 r/min離心20 min，將上清液冷凍干燥后備用。

1.4 玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)的制備

精確稱取一定量的玉米蛋白水解物，用去離子水配成質(zhì)量濃度為40 g/L的玉米蛋白溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH為10，加入殼寡糖的質(zhì)量與玉米蛋白溶液中水解物的質(zhì)量比為1∶1，將玉米蛋白水解物溶液與殼寡糖混合，用1 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)混合后溶液的pH為10，置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻樣品，冷凍干燥后備用。

1.5 蛋白含量測(cè)定

采用微量凱式定氮法，按GB 5009.5—2010執(zhí)行。

1.6 水解度測(cè)定

采用pH-stat法[12]。

1.7 抗氧化活性測(cè)定

將凍干后的玉米蛋白水解物和其糖基化產(chǎn)物配成蛋白濃度為0.05，0.10，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00 mg/mL的溶液。本試驗(yàn)設(shè)置2組對(duì)照，第1組是殼寡糖(濃度設(shè)定參考玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物，梯度濃度為0.025，0.050，0.250，0.500，1.500，2.500，3.500 mg/mL)對(duì)照組，第2組是殼寡糖加玉米蛋白水解物(濃度設(shè)定參考玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物，殼寡糖和玉米蛋白水解物混合后溶液的梯度濃度為0.05，0.10，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00 mg/mL)對(duì)照組。

1.7.1 Fe2+螯合能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]。

1.7.2 ·OH清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]。

1.7.3 DPPH·清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]。

1.8 分子量分布的測(cè)定

用體積排阻色譜法。使用凝膠色譜柱Superdex Peptide 10/300 GL測(cè)定樣品中可溶性蛋白的分子量分布。準(zhǔn)確稱取2 mg凍干后玉米蛋白粉水解液和其糖基化樣品，溶解于1 mL pH為7.0 的20 mmol/L的PBS緩沖溶液(含0.15 mol/L NaCl)中，樣品溶液在10 000 r/min離心10 min，將上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后上樣，上樣量為100 μL，用pH 為7.0的20 mmol/L的PBS緩沖溶液(含0.15 mol/L NaCl)洗脫，流速為0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。

用來(lái)標(biāo)定分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有藍(lán)色葡聚糖2 000(2 000 kDa，濃度2 mg/mL)、aprotinine(6 511.51 Da，濃度1 mg/mL)、桿菌肽(1 422.69 Da，濃度2 mg/mL)、氧化性谷胱甘肽(612.63 Da，濃度3 mg/mL)和還原性谷胱甘肽(307.32 Da，濃度3 mg/mL)，使用pH 7.0、20 mmol/L的PBS緩沖溶液配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在10 000 r/min 離心10 min，再將上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后上樣，上樣量為100 μL，洗脫液用pH 為7.0、20 mmol/L的PBS緩沖溶液(含0.15 mol/L NaCl)，流速為0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中粗蛋白含量

玉米蛋白粉經(jīng)去淀粉、酶解、糖基化反應(yīng)后分別獲得去淀粉玉米蛋白粉、玉米蛋白水解物、玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物，各個(gè)樣品的粗蛋白含量見(jiàn)表1。

表1 樣品粗蛋白含量Table 1 Sample crude protein content %

試驗(yàn)中使用的玉米蛋白粉是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物，里面還含有不少的淀粉，經(jīng)過(guò)去淀粉預(yù)處理后，玉米蛋白粉的蛋白含量提高了23%左右。玉米蛋白水解物的蛋白含量相較于去淀粉玉米蛋白粉的降低了13%左右，因?yàn)橛衩椎鞍字兄饕谴既艿鞍缀凸鹊鞍?，在水溶液中的溶解性差，酶解后離心，發(fā)現(xiàn)還有少量的玉米蛋白沉淀殘留，此時(shí)的水解度為(33.18±1.54)%。玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物的粗蛋白含量較玉米蛋白水解物的降低了19.36%。

2.2 抗氧化活性

抗氧化能力主要是用于評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基的清除能力，其中·OH可以引起脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，F(xiàn)e2+螯合能力可以有效地減少·OH的產(chǎn)生，DPPH·是人工合成的，它既是抗氧化劑又是自由基指示劑，所以·OH清除率、Fe2+螯合能力和DPPH·清除率是評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除率的重要指標(biāo)。研究[13]表明玉米蛋白水解物具有一定的抗氧化活性，且玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物在一定程度上可以提高玉米蛋白水解物的抗氧化活性。

2.2.1 Fe2+螯合能力 蛋白質(zhì)與Fe2+螯合能力可以反映出生命體對(duì)礦物元素的吸收利用情況，F(xiàn)e2+可以催化活性氧形成自由基，氧化不飽和脂類，所以蛋白質(zhì)對(duì)Fe2+螯合能力越強(qiáng)，越可以減緩蛋白質(zhì)被氧化，說(shuō)明蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化活性。玉米蛋白水解物(CGH)、玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)及對(duì)照樣品在不同濃度下與Fe2+螯合能力見(jiàn)圖1。

由圖1可知，殼寡糖對(duì)Fe2+螯合能力較弱，CGG和CGH在低蛋白濃度時(shí)Fe2+螯合能力也較弱，隨著蛋白濃度的提高螯合能力不斷加強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系。在蛋白濃度為0.10～0.50 mg/mL時(shí)螯合能力有顯著的提高，此時(shí)CGG和CGH的Fe2+螯合能力分別提高了3.1倍和8.9倍。CGH+殼寡糖組的Fe2+螯合能力比CGG組和CGH組的都要小，說(shuō)明CGH和殼寡糖之間有糖基化反應(yīng)的發(fā)生。從圖1 的整體趨勢(shì)可以看出，玉米蛋白水解物經(jīng)過(guò)美拉德糖基化改性后，F(xiàn)e2+螯合能力均有不同程度的提高，說(shuō)明美拉德糖基化修飾玉米蛋白水解產(chǎn)物可以通過(guò)與Fe2+螯合來(lái)阻止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，消除自由基的氧化對(duì)機(jī)體造成傷害。汪姣玲[14]研究乳清蛋白美拉德糖基化改性時(shí)，發(fā)現(xiàn)改性后的蛋白質(zhì)Fe2+螯合能力是原蛋白的1.64倍，·OH清除率增長(zhǎng)了20.82倍，DPPH·清除率增長(zhǎng)了2.35倍，與本研究結(jié)果基本一致，美拉德改性技術(shù)可以增強(qiáng)蛋白的抗氧化活性。

圖1 蛋白濃度對(duì)Fe2+螯合能力的影響Figure 1 Effect of protein concentration on Fe2+-chelating abilities

從圖1中還可以看出，隨著蛋白濃度的不斷升高，CGH和CGG的Fe2+螯合能力均出現(xiàn)不同程度的降低，可能是玉米蛋白粉沒(méi)有經(jīng)過(guò)去色素預(yù)處理，隨著蛋白濃度的不斷增高，蛋白溶液的顏色不斷加深，會(huì)影響測(cè)定時(shí)的吸光值，使后期Fe2+螯合能力下降。由圖2、3可知，后期隨著蛋白濃度的升高，·OH清除率和DPPH·清除率也出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。

2.2.2 ·OH清除率 不同蛋白濃度的玉米蛋白水解物(CGH)、玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)及對(duì)照樣品的·OH清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白濃度對(duì)·OH清除率的影響Figure 2 Effect of protein concentration on hydroxyl radical scavenging activities

由圖2的整體趨勢(shì)可以看出，殼寡糖自身具有顯著的·OH 清除能力，且隨著殼寡糖濃度的增加，·OH清除率在不斷的增加，達(dá)到一定濃度后，增加趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。CGG的·OH清除能力比CGH強(qiáng)，且兩者的·OH清除能力在一定濃度范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。CGG清除·OH能力增強(qiáng)，可能是因?yàn)樗鳛榻饘衮蟿?，能夠與Fe2+螯合并抑制·OH 的產(chǎn)生，這與2.2.1中的試驗(yàn)結(jié)果一致。CGH在蛋白濃度為3.00 mg/mL時(shí)·OH清除率達(dá)到最高值為55.98%，而CGG在蛋白濃度為5.00 mg/mL時(shí)·OH清除率達(dá)到了最高值為90.91%。在蛋白濃度為5.00 mg/mL時(shí)對(duì)應(yīng)的CGH、CGH+殼寡糖組和殼寡糖的·OH清除率分別為42.12%，76.38%，73.00%，發(fā)現(xiàn)此時(shí)CGG的·OH清除率為90.91%，比CGH、CGH+殼寡糖組和殼寡糖的高，說(shuō)明CGH和殼寡糖之間發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。美拉德糖基化反應(yīng)對(duì)玉米蛋白水解物的·OH清除率有較為明顯的加強(qiáng)，與尹晨玲等[15]研究的美拉德反應(yīng)可以提高酶解后蛋白的·OH清除率結(jié)果相一致。

2.2.3 DPPH·清除率 不同蛋白濃度的玉米蛋白水解物(CGH)、玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)及對(duì)照樣品的DPPH·清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

DPPH是一種含發(fā)色團(tuán)的化合物，溶解在乙醇中后呈深紫色，可直接與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)。由圖3可知，CGH、CGG和殼寡糖對(duì)DPPH·都有一定清除能力，在蛋白濃度為0.50～7.00 mg/mL 時(shí)CGH+殼寡糖組的DPPH·清除率約為CGH和殼寡糖的簡(jiǎn)單加和，而CGH的DPPH·清除率比CGH+殼寡糖組的低，可以推斷CGH與殼寡糖發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。不同濃度下CGG的DPPH·清除率都要比CGH的高，說(shuō)明美拉德糖基化改性改善了CGH對(duì)DPPH·的清除能力，可能是與CGH共價(jià)結(jié)合的殼寡糖能夠向DPPH·提供氫原子，使DPPH·形成穩(wěn)定的DPPH-H物質(zhì)。Gottardi等[16]在研究小麥蛋白水解物時(shí)，發(fā)現(xiàn)美拉德糖基化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一種具有增強(qiáng)抗氧化能力的產(chǎn)物，與本研究結(jié)果一致。CGG和CGH在蛋白濃度均為5.00 mg/mL時(shí)DPPH·清除率達(dá)到了最大值，分別為61.75%和29.49%，此時(shí)殼寡糖和CGH+殼寡糖組的值為69.88%和86.49%，比CGG和CGH的高。說(shuō)明美拉德糖基化反應(yīng)可以有效地提高蛋白水解物的DPPH·清除率，且影響自由基清除率的不是簡(jiǎn)單依靠殼寡糖和蛋白水解物對(duì)自由清除率的簡(jiǎn)單疊加。另外，從圖3的整體變化趨勢(shì)可以得到，蛋白水解物的抗氧化活性與蛋白濃度之間存在劑量依賴關(guān)系。這與Oh等[17]研究山藥蛋白及其糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性時(shí)，提出的蛋白濃度與抗氧化物活性之間有劑量依賴關(guān)系相符。

總的來(lái)說(shuō)，玉米蛋白水解物經(jīng)美拉德糖基化修飾后，抗氧化活性顯著增強(qiáng)，且抗氧化活性與蛋白濃度之間具有量效關(guān)系。

圖3 樣品的蛋白濃度對(duì)DPPH·清除率的影響Figure 3 Effect of protein concentration on DPPH radical scavenging activities

2.3 CGH、CGG的分子量分布

采用凝膠過(guò)濾色譜分析玉米蛋白酶解產(chǎn)物和糖基化產(chǎn)物的分子量分布情況。玉米蛋白酶解產(chǎn)物和其糖基化產(chǎn)物的分子量分布見(jiàn)圖4。

如圖4所示，經(jīng)計(jì)算可知，在復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同作用下，CGH的分子量在6 500 Da以下的約占總數(shù)的98%，其中分子量在1 000 Da以下的小分子多肽約占總數(shù)的75%，可以看出復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同水解能很好地將玉米蛋白粉中大蛋白分子切割成小分子玉米多肽。CGG的分子量在6 500 Da以下的約占總數(shù)的96%，其中分子量在1 000 Da以下的小分子多肽約占總數(shù)的71%。分子量在200 Da以下的CGH約占總數(shù)的18%，而CGG約占總數(shù)的5%，可以看出玉米蛋白經(jīng)美拉德糖基化后，美拉德糖基化產(chǎn)物的分子量略有升高。據(jù)報(bào)道[18]小分子多肽與大分子蛋白質(zhì)相比，具有可以迅速提供能量、消化吸收利用率高和生物活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。再由圖1～3可以看出，玉米蛋白水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，所以玉米蛋白粉經(jīng)過(guò)雙酶協(xié)同作用后可以提高玉米蛋白粉在食品行業(yè)的利用價(jià)值。

圖4 CGH和CGG的分子量分布洗脫圖譜Figure 4 Molecular weight distribution elution curve of CGH and CGG

3 結(jié)論

美拉德糖基化可以增強(qiáng)玉米蛋白水解物的抗氧化活性，CGH和CGG隨著蛋白濃度的增加，抗氧化活性上升趨勢(shì)明顯，在一定的蛋白濃度范圍內(nèi)劑量依賴關(guān)系明顯。后續(xù)將利用細(xì)胞試驗(yàn)繼續(xù)研究CGH和CGG的抗氧化活性，并對(duì)比兩者之間的區(qū)別。美拉德糖基化改性蛋白質(zhì)在食品中的應(yīng)用潛力巨大，并且正在逐步擴(kuò)大到功能食品行業(yè)中，本研究在功能食品生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。