復(fù)合酶水解卵白蛋白及其特性與結(jié)構(gòu)分析

劉麗莉 陳 珂 李 玉 代曉凝 孟圓圓

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

中國(guó)是世界上第一雞蛋生產(chǎn)大國(guó)，蛋品深加工比例卻不到1%[1]，這種現(xiàn)狀嚴(yán)重限制了中國(guó)蛋品行業(yè)的發(fā)展。雞蛋清粉是蛋品深加工中產(chǎn)量最大的制品之一，但它的功能特性及局限性影響了其在食品加工中的應(yīng)用。卵白蛋白又稱卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)，是雞蛋清中的主要成分，其分子量為44.5 kDa[2]。等電點(diǎn)為4.5，由4個(gè)自由巰基和1個(gè)包埋在OVA中心的二硫鍵組成[3]。OVA中疏水氨基酸含量為50%[4]。OVA作為模式蛋白能較好地體現(xiàn)雞蛋清的功能特性。

目前，提高蛋白質(zhì)的功能特性主要是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)改性實(shí)現(xiàn)的[5]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于雞蛋清蛋白改性的報(bào)道有很多，如許美玉等[6]通過(guò)堿性蛋白酶酶解改善OVA的乳化性，并優(yōu)化了酶解工藝條件，使其酶解OVA的乳化活性較未改性O(shè)VA提高了89.61%。Lechevalier等[7]研究了干熱處理對(duì)蛋清粉功能、營(yíng)養(yǎng)和過(guò)敏性的影響。Xiong等[8]研究了高強(qiáng)度超聲波(HIUS)對(duì)OVA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響。本課題組[9]前期利用堿性蛋白酶對(duì)OVA進(jìn)行酶解處理，發(fā)現(xiàn)酶解后OVA溶解度和乳化性明顯提高。酶法改性可以將大分子的蛋白質(zhì)降解成小分子肽甚至更小的氨基酸，同時(shí)產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)，從而提高了人體對(duì)其的消化吸收[10]。

市場(chǎng)上的雞蛋清粉由于溶解度差、腥味重等缺點(diǎn)限制了其在食品加工中的應(yīng)用，所以需要應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)蛋清粉進(jìn)行改性以開(kāi)發(fā)出功能特性較好的蛋清粉。而針對(duì)OVA改性的探討對(duì)提高整體蛋清粉的功能特性起到關(guān)鍵作用。生物酶解改性方法是當(dāng)前蛋白質(zhì)較為理想的改性方法，它具有安全、高效、作用條件溫和的優(yōu)點(diǎn)。但目前針對(duì)酶解OVA改性的相關(guān)文獻(xiàn)研究[6, 9]多集中在單一酶源的篩選和應(yīng)用，OVA的水解度偏低，而且缺乏針對(duì)酶解改性后OVA特性與結(jié)構(gòu)的深入分析。本試驗(yàn)擬在前期單一酶酶解OVA試驗(yàn)[9]基礎(chǔ)上，采用復(fù)合酶對(duì)OVA進(jìn)行酶解改性，以提高OVA的功能特性從而開(kāi)發(fā)出高附加值的功能性蛋清粉，為雞蛋深加工制品提供一種新途徑。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶(1.0×104U/g)、中性蛋白酶(5.0×104U/g)和風(fēng)味蛋白酶(1.6×104U/g)：上海藍(lán)季生物有限公司；

酒石酸鉀鈉：分析純，濟(jì)南金日和化學(xué)試劑有限公司；

溴酚藍(lán)、溴化鉀：分析純，上海一研生物有限公司；

尿素、三羥甲基氨基甲烷：分析純，上海山浦化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速分散均質(zhì)機(jī)：HD-1604型，北京杰瑞恒達(dá)科技有限公司；

磁力加熱攪拌器：78-1型，深圳美達(dá)儀器有限公司；

高速分散均質(zhì)機(jī)：HD-1604型，北京杰瑞恒達(dá)科技有限公司；

超速冷凍離心機(jī)：H1650型，北京興達(dá)恒信科技有限公司；

全自動(dòng)凱氏定氮儀：K9860型，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；

磁力加熱攪拌器：78-1型，深圳美達(dá)儀器有限公司；

熒光分光光度計(jì)：Cary eclipse型，美國(guó)Aglient公司；

掃描電鏡：EM-30Plus型，韓國(guó)COXEM公司。

1.2 方法

1.2.1 OVA的酶解工藝 稱取一定質(zhì)量的OVA粉溶解于蒸餾水中，配制成OVA溶液，調(diào)節(jié)溫度和pH，加入一定量的復(fù)合酶，再滴加NaOH來(lái)維持pH值恒定，反應(yīng)一段時(shí)間后，置于90 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻后于10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)水解度，將上清液冷凍干燥，即得OVA肽。

1.2.2 復(fù)合酶配比選擇 配制3%蛋白濃度的OVA溶液，pH為8，總酶量5 000 U/g(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比分別為2∶1∶1，1∶1∶2，1∶2∶1)，在50 ℃ 的水浴鍋中加熱4 h，測(cè)定其水解度。并以3種單一酶作為對(duì)照。

1.2.3 OVA酶解工藝優(yōu)化

(1) pH的選擇：固定酶解時(shí)間6 h，底物OVA濃度5%，加酶量8 000 U/g，溫度60 ℃，分別考察不同pH(5，6，7，8，9)對(duì)酶解反應(yīng)水解度的影響。

(2) 酶解時(shí)間的選擇：固定pH 7，底物OVA濃度5%，加酶量8 000 U/g，溫度60 ℃，分別考察不同酶解時(shí)間(2，4，6，8，10 h)對(duì)酶解反應(yīng)水解度的影響。

(3) 底物OVA濃度的選擇：固定pH 7，酶解時(shí)間6 h，加酶量8 000 U/g，溫度60 ℃，分別考察不同底物OVA濃度(2%，3%，4%，5%，6%，7%)對(duì)酶解反應(yīng)水解度的影響。

(4) 加酶量的選擇：固定pH 7，酶解時(shí)間6 h，底物OVA濃度5%，溫度60 ℃，分別考察不同加酶量(4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000 U/g)對(duì)酶解反應(yīng)水解度的影響。

(5) 溫度的選擇：固定pH 7，酶解時(shí)間6 h，底物OVA濃度5%，加酶量8 000 U/g，分別考察不同溫度(40，45，50，55，60，65 ℃)對(duì)酶解反應(yīng)水解度的影響。

1.2.4 OVA酶解的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.5軟件，以水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)五元二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)。

1.2.5 水解度測(cè)定 采用甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮含量，凱氏定氮法測(cè)定總氮含量[11]。水解度(DH)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

DH——水解度，%；

N1——上清液中氨基態(tài)氮含量，mol/L；

N0——樣品中總氮含量，mol/L。

1.2.6 OVA功能特性的測(cè)定

(1) 持水性和持油性的測(cè)定：稱取0.1 g待測(cè)樣品于離心管中稱量總重，加入3 mL水(或大豆油)，靜置30 min后，于10 000 r/min離心10 min，稱量沉淀與離心管總重[12]。按式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)持水性和持油性。

(2)

式中：

WAC——蛋白質(zhì)持水性，g/g；

OAC——蛋白質(zhì)持油性，g/g；

W0——待測(cè)樣品的重量，g；

W1——待測(cè)樣品和離心管的總重量，g；

W2——沉淀與離心管總重量，g。

(2) 表面疏水性的測(cè)定：參照Chelh等[13]的方法，將OVA、OVA肽分別溶于pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，加入1 mg/mL 溴酚藍(lán)溶液200 μL，于10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋10倍后在595 nm處測(cè)定吸光值，以Tris-HCl緩沖液為空白，以1 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖液加1 mg/mL 溴酚藍(lán)為對(duì)照。蛋白質(zhì)表面疏水性按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

SH——蛋白質(zhì)表面疏水性，%；

A0——1 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖液加1 mg/mL溴酚藍(lán)為對(duì)照的吸光值；

A1——上清液稀釋10倍后在595 nm處測(cè)定吸光值。

(3) 濁度的測(cè)定：取一定量的OVA、OVA肽分別加入pH 7.4的Tris-HCl緩沖液，配制成2.5 mg/mL溶液，于6 000 r/min 均質(zhì)1 min，使其充分溶解，以不加樣品的Tris-HCl緩沖液作為空白組，在340 nm處測(cè)定樣品吸光度值(A340 nm)，吸光值表示其濁度[14]。

1.2.7 OVA結(jié)構(gòu)表征

(1) 化學(xué)作用力的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法，修改如下，準(zhǔn)確稱取1 g OVA和OVA肽，分別加入10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)、0.6 mol/L NaCl+8.0 mol/L尿素(SD)、0.6 mol/L NaCl+8.0 mol/L尿素+1.5 mol/Lβ-巰基乙醇(SE)，于10 000 r/min均質(zhì)1 min后，4 ℃靜置2 h，然后于10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算上清液中不同蛋白質(zhì)含量。分別按式(4)～(7)計(jì)算離子量含量、氫鍵含量、疏水相互作用含量和二硫鍵含量。

IC=C2-C1，

(4)

HB=C3-C2，

(5)

HI=C4-C3，

(6)

DB=C5-C4，

(7)

式中：

IC——離子量含量，%；

HB——?dú)滏I含量，%；

HI——疏水相互作用含量，%；

DB——二硫鍵含量，%；

C1——溶解于SA的蛋白質(zhì)含量，%；

C2——溶解于SB的蛋白質(zhì)含量，%；

C3——溶解于SC的蛋白質(zhì)含量，%；

C4——溶解于SD的蛋白質(zhì)含量，%；

C5——溶解于SE的蛋白質(zhì)含量，%。

(2) 熒光光譜分析：將待測(cè)樣品溶于pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，配制成濃度為1 mg/mL的蛋白溶液，激發(fā)和發(fā)射單色器的帶寬均為5 nm，在激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，掃描范圍300～450 nm的條件下，測(cè)定待測(cè)樣品的熒光發(fā)射光譜。

(3) 掃描電鏡(SEM)分析：分別將OVA、OVA肽進(jìn)行噴金處理，再將樣品置于掃描電子顯微鏡下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶配比的篩選

復(fù)合酶配比對(duì)OVA水解度的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，采用復(fù)合酶酶解OVA的水解度顯著優(yōu)于單一酶(P<0.05)；而且不同配比的復(fù)合酶酶解OVA水解度的順序?yàn)?∶1∶2>1∶2∶1>2∶1∶1，當(dāng)3種酶的質(zhì)量比為1∶1∶2時(shí)，水解度達(dá)到最大值，為26.54%，故3種酶復(fù)合的比例選用1∶1∶2。

圖1 復(fù)合酶配比對(duì)OVA水解度的影響Figure 1 Effect of enzyme ratio on degree of hydrolysis and of OVA

2.2 單因素試驗(yàn)

不同酶解條件對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

由圖2(a)可知，當(dāng)pH<7時(shí)，水解度隨著pH升高而升高；當(dāng)pH>7時(shí)，水解度隨著pH的升高而下降；當(dāng)pH為7時(shí)，水解度達(dá)到最大值?？赡苁?種酶的最適pH均在7左右[16]，當(dāng)pH>7時(shí)，酶的活性受到影響，水解度降低，因此OVA的酶解pH為7時(shí)較為適宜。

由圖2(b)可知，水解度隨著OVA酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先升高后下降的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間為6 h時(shí)，水解度出現(xiàn)最大值?？赡苁窃谝欢附鈺r(shí)間內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶作用在OVA上，使其斷裂成大小不一的多肽分子，OVA中可被酶解的肽鍵逐漸增多，水解度變大；而后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性下降，進(jìn)而造成水解度逐步下降[17]。因此酶解時(shí)間選擇6 h。

由圖2(c)可知，當(dāng)OVA濃度<5%時(shí)，水解度逐漸增加；當(dāng)OVA濃度>5%時(shí)，水解度呈逐漸下降趨勢(shì)。這可能是當(dāng)OVA濃度逐漸增大時(shí)，復(fù)合酶和OVA結(jié)合的幾率增大，OVA酶解較徹底，水解度逐漸增大；而當(dāng)OVA濃度繼續(xù)增大時(shí)，導(dǎo)致酶與蛋白之間接觸減小，酶解液黏度變大，溶解性降低，OVA酶解進(jìn)行較慢，從而導(dǎo)致水解度降低[18]。因此，OVA濃度選定為5%。

由圖2(d)可知，水解度隨著加酶量的增加，呈先增加后減少的趨勢(shì)。原因是隨著加酶量的增加，酶與OVA結(jié)合的幾率增大，反應(yīng)速率升高，水解度相應(yīng)增大；但隨著加酶量的增多，底物OVA相對(duì)不足，導(dǎo)致反應(yīng)進(jìn)程減弱，水解度逐漸減小。因此，加酶量選定為8 000 U/g。

由圖2(e)可知，隨著溫度的升高，水解度先上升后下降；在60 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值。可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白酶變性，從而使酶解反應(yīng)速率降低[19]。所以，溫度選定為60 ℃。

2.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)

通過(guò)五因素三水平通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)對(duì)復(fù)合酶酶解制備OVA肽的工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

圖2 酶解條件對(duì)水解度的影響Figure 2 Influence of different enzymatic conditions on degree of hydrolysis表1 五元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in second-ordel rotation combination experimental design

水平X1 pHX2 酶解時(shí)間/hX3 底物OVA濃度/%X4 加酶量/(U·g-1)X5 溫度/℃-26.06.03.07 00050.0-16.56.54.07 50052.507.07.05.08 00055.017.57.56.08 50057.528.08.07.09 00060.0

表2五元二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimental design in terms of coded values of five variables and corresponding experimental results

試驗(yàn)號(hào)X1X2X3X4X5水解度/%11111127.132111-1-129.68311-11-127.68411-1-1129.4951-111-126.6261-11-1130.9971-1-11130.4681-1-1-1-126.069-1111-127.4110-111-1130.9611-11-11127.5812-11-1-1-126.4513-1-111127.6314-1-11-1-126.6415-1-1-11-125.8116-1-1-1-1125.0917-2000026.55182000028.37190-200027.82200200028.792100-20025.59220020027.1223000-2029.23240002026.79250000-228.12260000230.59270000030.28280000030.59290000030.29300000031.08310000030.12320000031.14

對(duì)表2中水解度的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到水解度的回歸方程為：

(8)

該水解度模型在α=0.05水平下剔除不顯著項(xiàng)后的回歸方程為：

(9)

2.3.1 方差分析和顯著性檢驗(yàn) 由表3可知，Y1回歸模型的R2=96.43，P<0.000 1，差異極顯著，失擬項(xiàng)P=0.158 6>0.05，差異不顯著，說(shuō)明Y1模型的擬合度較高。因此該回歸模型可以較好地反映自變量與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。

2.3.2 雙因素交互效應(yīng)分析 由圖3可知，響應(yīng)面呈拋物線形，等高線呈橢圓形，說(shuō)明底物OVA濃度與加酶量的交互作用對(duì)水解度影響極顯著，這與表3中顯著性分析結(jié)果一致。由等高線的變化趨勢(shì)可看出，當(dāng)?shù)孜颫VA濃度低于5.0%～5.5%中某固定值、加酶量低于7 750～8 000 U/g中某固定值時(shí)，隨著底物OVA濃度與加酶量增加，水解度增加；當(dāng)?shù)孜颫VA濃度高于5.0%～5.5%中某固定值、加酶量高于7 750～8 000 U/g中某固定值時(shí)，隨著底物OVA濃度與加酶量的增加，水解度減小；當(dāng)?shù)孜颫VA濃度為5%、加酶量為8 000 U/g時(shí)，水解度為30.28%。

由圖4可知，酶解時(shí)間與加酶量的響應(yīng)面呈拋物線形且

表3 水解度的方差分析表Table 3 Analysis of variance for the hydrolysis degree

圖4 酶解時(shí)間與加酶量交互作用對(duì)水解度的影響Figure 4 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of interaction of hydrolysis time and enzyme dosage on degree of hydrolysis

比較陡峭，等高線呈明顯的橢圓形，說(shuō)明酶解時(shí)間與加酶量對(duì)水解度影響有極顯著的交互作用。由等高線的變化趨勢(shì)可看出，當(dāng)酶解時(shí)間低于7.0～7.3 h中某固定值、加酶量低于7 750～8 000 U/g中某固定值時(shí)，隨著底物OVA濃度與加酶量增加，水解度增加；當(dāng)?shù)孜颫VA濃度高于7.0～7.3 h中某固定值、加酶量高于7 750～7 938 U/g中某固定值時(shí)，隨著底物OVA濃度與加酶量的增加，水解度減小。

2.4 利用回歸方程確定最佳作用參數(shù)和模型驗(yàn)證

經(jīng)五元二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化法，采用Design Expert 8.0軟件和回歸方程分析得到復(fù)合酶酶解OVA的最佳工藝為：pH 7.5、酶解時(shí)間7.29 h、底物OVA濃度5.28%、加酶量7 529.72 U/g、溫度56.42 ℃，此時(shí)水解度為31.22%。為了提高復(fù)合酶酶解制備OVA肽試驗(yàn)的操作性和驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，將預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝條件修改為：pH 7.5、酶解時(shí)間7 h、底物OVA濃度5%、加酶量7 500 U/g、溫度56 ℃。在此條件下做3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得水解度為(31.03±0.14)%。水解度的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相差0.61%，說(shuō)明水解度的模型方程與實(shí)際結(jié)果擬合度良好，證明響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶酶解OVA的工藝條件是可行的。

2.5 復(fù)合酶酶解對(duì)OVA功能特性的影響

由表4可知，OVA肽的持水性較OVA提高了1.65 g/g?？赡苁敲附馐沟鞍追肿訑嗔眩纬尚》肿与逆?，從而使其結(jié)合水的能力增強(qiáng)，持水性增強(qiáng)[20]。與持水性相反，OVA肽的持油性較OVA降低了1.05 g/g，主要是蛋白的持油性與表面疏水性有關(guān)，表面疏水基團(tuán)減少，與油結(jié)合機(jī)會(huì)減少造成的。OVA肽較OVA的表面疏水性大小明顯減小了4.05%(P<0.05)，造成的主要原因是復(fù)合酶酶解得到的OVA肽的溶解度升高，表面疏水性相應(yīng)降低[21]。OVA肽的濁度大小呈下降趨勢(shì)且差異顯著[22](P<0.05)，這是因?yàn)镺VA肽是由OVA經(jīng)酶解得到了分子量較小的多肽或者氨基酸，OVA肽能與水形成氫鍵，使其溶解度較OVA升高濁度下降[23]。

2.6 復(fù)合酶水解OVA結(jié)構(gòu)表征

2.6.1 化學(xué)作用力分析 酶解改性對(duì)OVA化學(xué)作用力即離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵的影響見(jiàn)表5。相對(duì)于OVA，OVA肽的離子鍵含量明顯減少(P<0.05)，這是因?yàn)槊附飧男允沟秒x子鍵發(fā)生了斷裂，導(dǎo)致OVA肽的離子鍵含量較OVA分別下降6.63%。氫鍵的穩(wěn)定性弱于離子鍵，經(jīng)酶解處理后的OVA即OVA肽的氫鍵發(fā)生斷裂使其含量較OVA明顯減少17.29%(P<0.05)。OVA肽的疏水相互作用含量較OVA分別減少4.35%，可能是酶解使蛋白質(zhì)分子量變小，親水基團(tuán)增多，溶解性升高，疏水相互作用減弱；另外，OVA肽的羰氨縮合破壞了蛋白質(zhì)分子的疏水性相互作用，最終導(dǎo)致OVA肽的疏水相互作用含量較OVA明顯減少(P<0.05)。相對(duì)于OVA，酶解制備的OVA肽的二硫鍵含量均明顯減少(P<0.05)，可能是酶解改性破壞了半胱氨酸殘基，使二硫鍵的形成受阻[24]。

表4 酶解改性對(duì)OVA功能性質(zhì)的影響?Table 4 Effect of the enzymatic modification on functional properties of OVA

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5 酶解改性對(duì)OVA化學(xué)作用力的影響?Table 5 Effect of the enzymatic modification on chemical reaction of OVA %

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6.2 熒光光譜分析 對(duì)OVA和復(fù)合酶酶解制備的OVA肽進(jìn)行熒光光譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

從圖5可以看出，相對(duì)于OVA，OVA肽的熒光強(qiáng)度均有所降低；最大吸收峰位置也發(fā)生了改變，OVA的最大吸收峰在340 nm處，OVA肽的最大吸收峰紅移至345 nm處?？赡苁菬晒鈴?qiáng)度與表面疏水性呈正相關(guān)，酶解改變了OVA的空間構(gòu)象，使其氫鍵更加穩(wěn)定，表面疏水性降低，OVA肽熒光強(qiáng)度減弱。

2.6.3 掃描電鏡(SEM)分析 對(duì)OVA和復(fù)合酶酶解制備的OVA肽進(jìn)行SEM測(cè)定分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6中可知，OVA為典型的球蛋白，表面光滑，成顆粒狀。酶解之后，表面不規(guī)則的凹陷消失，顆粒變小。說(shuō)明酶解改性使其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

圖5 熒光光譜分析Figure 5 Analysis of fluorescence spectroscopy

圖6 改性前后OVA的SEM圖Figure 6 Scanning electron micrographs of OVA before and after modification

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶水解OVA及其特性與結(jié)構(gòu)，確定了3種酶的最佳質(zhì)量比和最適酶解工藝條件。結(jié)果表明，與單一酶相比，復(fù)合酶顯著性提高了OVA的水解度。通過(guò)對(duì)改性后的OVA特性分析表明，酶解作用顯著提高了OVA的功能特性，如持水性提高、表面疏水性和濁度降低等。為了更加深入地了解OVA相關(guān)功能性質(zhì)變化的機(jī)理，通過(guò)測(cè)定化學(xué)作用力分析經(jīng)酶解改性后OVA的離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵的變化；采用熒光光譜和掃描電鏡觀察改性后OVA結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明蛋白質(zhì)的三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，同時(shí)，OVA的微觀結(jié)構(gòu)由球狀完全變成片狀，表明酶解改性對(duì)OVA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著性的影響。但針對(duì)改性后的OVA結(jié)構(gòu)與功能特性之間的構(gòu)效機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入探討。