嗜熱α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的決定因素及提高策略

李才明 陳雙娣 顧正彪 洪 雁 程 力 李兆豐

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122； 3. 江南大學(xué)食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122)

酶是一種具有生物催化活性的蛋白質(zhì)。通常，在溫度高于50～60 ℃時(shí)，酶蛋白會(huì)發(fā)生變性而失去相應(yīng)的活性，這種在高溫下的不穩(wěn)定性嚴(yán)重影響其應(yīng)用[1]。然而，嗜熱酶作為生物催化劑有著許多獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，包括：① 穩(wěn)定性提高，貯存、運(yùn)輸成本降低；② 反應(yīng)效率提高；③ 對(duì)反應(yīng)的冷卻系統(tǒng)要求低，利于能耗及成本的降低；④ 在高的反應(yīng)溫度下，能減少雜菌污染；⑤ 在高溫下，反應(yīng)體系黏度降低，有利于傳質(zhì)。因此，嗜熱酶的開發(fā)已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

嗜熱α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)是目前工業(yè)上最重要的酶制劑之一，在食品、紡織、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)中有著十分廣泛的應(yīng)用。作為一種淀粉內(nèi)切酶，其作用方式是隨機(jī)切斷淀粉或糖原分子內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，使淀粉黏度迅速下降，生成葡萄糖、麥芽糖、低聚糖和可溶性糊精[2-3]。因此，在淀粉的酶轉(zhuǎn)化工業(yè)應(yīng)用中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。一般地，所有淀粉的酶轉(zhuǎn)化都包括糊化、液化和糖化過(guò)程。首先，通過(guò)加熱淀粉水溶液可達(dá)到糊化的作用，為了淀粉糊化后能夠立即進(jìn)行液化、糖化反應(yīng)而避免過(guò)長(zhǎng)的冷卻時(shí)間，就需要在較高溫度下穩(wěn)定性較好的淀粉酶。因此，具有特殊耐熱性的嗜熱α-淀粉酶被廣泛地用來(lái)滿足更高的溫度要求，進(jìn)而促進(jìn)整個(gè)淀粉加工業(yè)的發(fā)展。另外，嗜熱α-淀粉酶作為嗜熱酶的典型代表，在嗜熱酶的研究、開發(fā)及應(yīng)用中扮演著重要的角色，并有助于探索蛋白質(zhì)達(dá)到極端熱穩(wěn)定性的相關(guān)機(jī)理。本文主要對(duì)嗜熱α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的決定因素及其熱穩(wěn)定性提高策略進(jìn)行全面的綜述。

1 嗜熱α-淀粉酶的來(lái)源

嗜熱α-淀粉酶有多種來(lái)源，包括植物、動(dòng)物和微生物，并在這些來(lái)源的碳水化合物代謝中扮演重要角色。盡管α-淀粉酶分布廣泛，但微生物來(lái)源的，尤其是真菌的和細(xì)菌的α-淀粉酶因其成本、效率、一致性、對(duì)產(chǎn)品更少的時(shí)間/空間上的要求以及方便確定和優(yōu)化工藝條件而應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[4]。

在細(xì)菌中，芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于嗜熱α-淀粉酶的生產(chǎn)以滿足工業(yè)的需求?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)被認(rèn)為是嗜熱α-淀粉酶的優(yōu)良生產(chǎn)者，也廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)具有不同商業(yè)用途的酶。特別是古菌α-淀粉酶與芽孢桿菌α-淀粉酶相比具有極好的嗜熱特性，表1列出了部分微生物來(lái)源的嗜熱α-淀粉酶。

表1 嗜熱α-淀粉酶的微生物來(lái)源及性質(zhì)Table 1 Microbial origins and properties of thermophilic α-Amylase

2 嗜熱α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的決定因素

酶的熱穩(wěn)定性涉及到在高溫條件下多肽鏈的化學(xué)特性和空間立體結(jié)構(gòu)的變化，嗜熱α-淀粉酶可作為分析熱穩(wěn)定性的模型。有關(guān)嗜熱α-淀粉酶穩(wěn)定性的研究不僅有助于對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性機(jī)制的理解，還可以幫助開發(fā)適于工業(yè)生產(chǎn)中的對(duì)熱更穩(wěn)定的酶。

通過(guò)同源序列比對(duì)，結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)分析結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性方面的關(guān)系，揭示了一些導(dǎo)致嗜熱α-淀粉酶熱穩(wěn)定性高的重要因素，但并未得到單一的、普遍的機(jī)制，而是眾多因素綜合作用的結(jié)果。同時(shí)，熱穩(wěn)定性的分子機(jī)制隨酶的不同也存在差異。然而，一些共有的特征都被認(rèn)為是嗜熱α-淀粉酶熱穩(wěn)定的影響因素，主要包括：① 氨基酸的組成與分布，如嗜熱α-淀粉酶中的疏水性氨基酸通常高于中溫蛋白酶，這些疏水性氨基酸能增加蛋白質(zhì)的剛性和疏水性，從而提高嗜熱α-淀粉酶的耐熱性[20]。② 帶電荷氨基酸與不帶電荷氨基酸的比率，如相對(duì)于Ala、Val、Ser、Thr、Asn，嗜熱α-淀粉酶中的Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg含量偏高。③ 嚴(yán)格和緊湊的空間結(jié)構(gòu)?？臻g結(jié)構(gòu)緊湊，堆積密度增加，導(dǎo)致在一定溫度下，嗜熱α-淀粉酶較同源嗜溫蛋白酶有更低的熱運(yùn)動(dòng)水平和更小的彈性。④α-螺旋的穩(wěn)定性[21]15-19。嗜熱α-淀粉酶的α-螺旋中一般缺少β-分枝殘基(Val、Ile、Thr)，避免了α-螺旋中的蛋白質(zhì)伸展到更廣的區(qū)域，可能使嗜熱蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的剛性，從而較其嗜溫同源體有更好的抗熱能力[20]。⑤ 氫鍵數(shù)目[22-23]。較多的氫鍵數(shù)目，有利于氫鍵網(wǎng)絡(luò)的加強(qiáng)，因而嗜熱α-淀粉酶表現(xiàn)出更好的耐熱性。⑥ 更多的作用力，如離子相互作用、疏水相互作用、二硫鍵的數(shù)量、芳香基團(tuán)的相互作用[21]20-41。⑦ 金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的存在[24]。來(lái)源于B.stearothermophilus的Ca2+-Na+-Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)其熱穩(wěn)定性有著重要作用[25]。⑧ 去折疊熵值等。影響α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的主要因素還包括一些金屬離子的存在與否、底物和其他穩(wěn)定劑的情況等[26]。

來(lái)源于B.licheniformis的嗜熱α-淀粉酶(BLA)，是一個(gè)分子量約58 kDa的單體，存在一中心部位——α/β桶。作為其嗜溫同源體，來(lái)源于B.amyloliquefaciens的α-淀粉酶(BAA)，有著與BLA近似的分子量。Khajeh等[27]對(duì)BLA和BAA進(jìn)行了序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者存在很高的同源性，達(dá)88%。SWISS-MODEL結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果進(jìn)一步表明，BAA的3D結(jié)構(gòu)與BLA極為類似，這2種α-淀粉酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成成分也非常相似。通過(guò)GETAREA程序計(jì)算可獲得表面和水解作用，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜熱BLA的結(jié)構(gòu)較嗜溫BAA更靈活。特別地，結(jié)構(gòu)域B的許多突變?cè)谝欢ǔ潭壬夏軌蛴绊態(tài)LA的熱穩(wěn)定性，從而使其適應(yīng)不同溫度下的反應(yīng)。

3 α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的提高策略

α-淀粉酶熱穩(wěn)定性包括熱力學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。熱力學(xué)穩(wěn)定性是由酶的穩(wěn)定態(tài)自由能(ΔGstab)和變性溫度(Tm，50%蛋白質(zhì)去折疊時(shí)的溫度)決定的。動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性通過(guò)在特定溫度下酶的半衰期(t1/2)來(lái)描述[28]。

嗜熱α-淀粉酶與普通嗜溫酶相比，它們的堿基序列、酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制相似度很高，但上述因素的微小差異導(dǎo)致了嗜熱α-淀粉酶較普通淀粉酶有更好熱穩(wěn)定性。這種差異的存在，為α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的提高奠定了基礎(chǔ)。目前，α-淀粉酶的熱穩(wěn)定化技術(shù)按照原理可分為3種：物理法、化學(xué)法和生物法。

3.1 物理法

α-淀粉酶可以通過(guò)添加穩(wěn)定劑來(lái)達(dá)到增強(qiáng)熱穩(wěn)定性的效果。酶體系中添加穩(wěn)定劑后，其體系黏度會(huì)有所增加，體積排阻效應(yīng)得到了提高，靜電相互作用也會(huì)增強(qiáng)，這有利于改善酶所處的微環(huán)境，穩(wěn)定酶的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象，最終酶的熱穩(wěn)定性往往也因此而提高。常用的穩(wěn)定劑主要包括糖與多羥基化合物和鹽2類。

糖與多羥基化合物，常用的有以下幾種：淀粉、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、纖維素、曲拉通等。在酶體系中加入此類物質(zhì)，酶分子會(huì)因其周邊滲透質(zhì)的排斥而優(yōu)先被水化，從而酶分子的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)。不同的穩(wěn)定劑往往對(duì)酶有著不同的穩(wěn)定效果。作者[29]通過(guò)將15% PEG1000添加到來(lái)源于B.circulans的α-淀粉酶中，發(fā)現(xiàn)能將60 ℃的半衰期延長(zhǎng)6.5 倍。Yoon等[30]系統(tǒng)性地研究了不同多羥基化合物(如曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯醇)對(duì)豬胰腺α-淀粉酶(PPA)、人類唾液α-淀粉酶淀粉酶(HAS)、米曲霉α-淀粉酶淀粉酶(AOA)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BAA)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(BLA)這幾種α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加物及其添加量不同時(shí)，對(duì)不同酶的熱穩(wěn)定性影響結(jié)果也存在一定的差異。

鹽類物質(zhì)不同于糖或多羥基化合物，其對(duì)α-淀粉酶的穩(wěn)定原理是：鹽的添加引起鹽與酶分子非特異性結(jié)合現(xiàn)象的發(fā)生，減緩酶的變性，從而利于酶熱穩(wěn)定性的提高。其中有些鹽類物質(zhì)可作為酶的輔助因子在維持α-淀粉酶的構(gòu)象以及保持α-淀粉酶的活性方面扮演著重要角色，例如有些金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(比如Ca2+、Na+等)。因此，對(duì)于那些結(jié)構(gòu)中存在金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的α-淀粉酶，往酶體系中加入相應(yīng)的鹽(比如CaCl2、NaCl等)，能對(duì)酶起到激活作用或增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性。Yadav等[28]通過(guò)添加10 mmol/L Ca2+能將變性溫度Tm從48 ℃提高至71 ℃，大大增加了α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性。Maalej等[31]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Pseudomonasstutzeri的α-淀粉酶在50 ℃保溫1 h后的殘余活力只有約20%，而加入2 mmol/L Ca2+時(shí)，殘余活力能保留80%，說(shuō)明Ca2+對(duì)酶的穩(wěn)定性有很大的改善效果。

3.2 化學(xué)法

化學(xué)法主要利用的是化學(xué)試劑對(duì)酶的修飾作用。α-淀粉酶可以通過(guò)加入一定的試劑對(duì)酶的特定基團(tuán)修飾改造來(lái)改變?chǔ)?淀粉酶分子內(nèi)的作用力，進(jìn)而改變其結(jié)構(gòu)、功能?；瘜W(xué)修飾是α-淀粉酶穩(wěn)定的一個(gè)重要策略，在藥物蛋白的修飾中扮演著重要角色，可以有效降低蛋白免疫特性，提高其抗蛋白酶的水解能力，增強(qiáng)熱穩(wěn)定性，從而可以達(dá)到延長(zhǎng)半衰期的目的。Ismaya等[32]發(fā)現(xiàn)利用非極性的酸酐修飾α-淀粉酶能將其穩(wěn)定性提高18倍?；瘜W(xué)修飾對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響往往有兩方面，沒(méi)有普遍的適用標(biāo)準(zhǔn)，需根據(jù)酶的特點(diǎn)來(lái)選擇合適的試劑和修飾方法。另外，化學(xué)修飾會(huì)伴隨酶損失，不同批次容易存在差異性[33]。除此之外，化學(xué)修飾中所用試劑的安全性問(wèn)題是在酶的改性方面所面臨的最大考驗(yàn)之一。

另外，酶的固定化也是一種提高α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的有效策略，就是利用物理或/和化學(xué)方法將酶束縛或限制在某一區(qū)域，仍能保留酶特有的催化特征，并且能回收重復(fù)利用的一種技術(shù)[34]。王華等[35]以殼聚糖為載體，戊二醛交聯(lián)共價(jià)固定α-淀粉酶后，其酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。Defaei等[36]通過(guò)離子相互作用將α-淀粉酶固定在磁性納米粒子上，最適溫度從45 ℃升至55 ℃，穩(wěn)定性得到很大提高，能重復(fù)使用10次以上。但由于其工藝技術(shù)比較復(fù)雜，成本偏高而難以得到廣泛應(yīng)用。

3.3 生物法

蛋白質(zhì)工程是常見的一種生物手段，α-淀粉酶可以通過(guò)該方法來(lái)改變其氨基酸序列，從而改變結(jié)構(gòu)或者構(gòu)象，達(dá)到穩(wěn)定性提高的效果。最初，蛋白質(zhì)工程主要應(yīng)用于α-淀粉酶基因在菌株中的克隆表達(dá)[12]，最常規(guī)的做法是在合適的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)出具有良好熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶基因。如魏濤等[37]通過(guò)將來(lái)源于SolfolobustokodaiiStrain 7的高溫α-淀粉酶基因ST0817在大腸桿菌中克隆表達(dá)，獲得具有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的α-淀粉酶。除了克隆表達(dá)外，α-淀粉酶還采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行熱穩(wěn)定性的研究。α-淀粉酶除了存在易篩選、負(fù)突變株的可用性等優(yōu)點(diǎn)外，對(duì)α-淀粉酶基因也有了深刻透徹的了解，加上其在微生物像枯草芽孢桿菌(B.subtilis)中發(fā)酵的成熟性，成為蛋白質(zhì)中第一個(gè)采用分子生物學(xué)手段的研究對(duì)象。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)工程已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一，一方面被用來(lái)研究以增強(qiáng)蛋白質(zhì)如商品酶制劑的熱穩(wěn)定性，另外一方面也用于研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能之間的構(gòu)效關(guān)系。蛋白質(zhì)工程的技術(shù)策略主要有理性化設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化2種。

理性化設(shè)計(jì)作為α-淀粉酶分子改造最常用的一種方法，有著良好的前景，對(duì)于任何形式的蛋白質(zhì)工程都具有潛在的研究?jī)r(jià)值[20]。一般通過(guò)以下2種方式進(jìn)行：① 引入突變；② 通過(guò)非共價(jià)連接或形成二硫鍵將蛋白質(zhì)表面的環(huán)進(jìn)行固定?？梢栽诘鞍踪|(zhì)表面局部增加離子來(lái)連接非相鄰部位，并且不會(huì)導(dǎo)致像包埋殘基那樣產(chǎn)生排斥的范德華力或者造成α-淀粉酶構(gòu)象不穩(wěn)定而具有巨大的應(yīng)用潛力。該技術(shù)需以相關(guān)α-淀粉酶蛋白分子三維結(jié)構(gòu)為前提，探索α-淀粉酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間存在的關(guān)聯(lián)性，接著進(jìn)一步得到α-淀粉酶蛋白分子中與功能相關(guān)的氨基酸，最后采用分子生物學(xué)手段(如定點(diǎn)或盒式突變)以實(shí)現(xiàn)定向改造酶蛋白的理化特性。曾靜等[38]通過(guò)分析來(lái)源于極端嗜熱古生菌ThermococcuskodakarensisKOD1的α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列，構(gòu)建單突變體ApkAdsA180K，與D212間形成離子鍵，于90 ℃下的半衰期較ApkAds延長(zhǎng)了2 h。Li等[39]通過(guò)多重序列比對(duì)將來(lái)源于B.licheniformisα-淀粉酶的位于B域長(zhǎng)環(huán)內(nèi)187、188位點(diǎn)及附近的269位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建了突變體A269K/S187D/N188T，將其在95 ℃的半衰期提高了9倍，催化效率也提高了1.84倍。但理性化設(shè)計(jì)需以酶蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，這要求直接測(cè)定其晶體結(jié)構(gòu)或者采用生物分析軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬，一定程度上會(huì)增加該技術(shù)的難度，使過(guò)程也變得更加復(fù)雜和繁瑣化。

定向進(jìn)化又稱非理性化設(shè)計(jì)，該技術(shù)的出現(xiàn)推動(dòng)了蛋白質(zhì)工程進(jìn)入新的階段。定向進(jìn)化是指將自然演變的過(guò)程在試管中呈現(xiàn)，通過(guò)突變、重組使蛋白質(zhì)的性質(zhì)往最佳狀態(tài)進(jìn)化，以得到具有目標(biāo)性質(zhì)的變種體。相比于理性化設(shè)計(jì)，定向進(jìn)化的區(qū)別在于通過(guò)人為模擬自然進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行突變，最大特點(diǎn)在于該過(guò)程不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，可采用隨機(jī)突變技術(shù)，并與快速高通量篩選方法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)酶基因的體外改造。因此，定向進(jìn)化是一種比定點(diǎn)突變更強(qiáng)大、更有潛力的工程方法。目前，2種定向進(jìn)化的方法已被開發(fā)：① 隨機(jī)突變方法又稱為DNA重組，是將含DNA的酶基因片段通過(guò)PCR技術(shù)導(dǎo)入到原基因中進(jìn)行重新組裝以得到完整的基因；② 易錯(cuò)PCR技術(shù)和DNA重組技術(shù)的結(jié)合，是在每一次易錯(cuò)PCR循環(huán)中篩選出所需要的特性基因，然后通過(guò)DNA重組技術(shù)獲得最好的變體特征。Mabrouk等[23]通過(guò)易錯(cuò)PCR得到熱穩(wěn)定性更好的突變體MA-A27，將50 ℃的半衰期從30 min提升至70 min，55 ℃的半衰期從13 min提升至25 min。除了提高酶的熱穩(wěn)定性外，該方法也被廣泛用于酶的其他特性改造，如改善酶的底物特異性、提高酶在溶劑中的活性或者提高嗜熱酶在酸性條件下的溫度等[40-41]。但是定向進(jìn)化技術(shù)還存在以下問(wèn)題：隨機(jī)性強(qiáng)，工作量大，費(fèi)時(shí)，成功率低等。

不同行業(yè)對(duì)不同生理生化特性的α-淀粉酶的需求促進(jìn)了該酶的研究與發(fā)展。酶/蛋白質(zhì)工程包括將所需的特性整合在適當(dāng)?shù)幕蛏希菍?shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的很有前途的技術(shù)手段。

4 展望

嗜熱α-淀粉酶不僅在蛋白質(zhì)熱力學(xué)穩(wěn)定性的基本原理方面，而且在穩(wěn)定性和催化效率之間的關(guān)系方面都激發(fā)著人們濃厚的研究興趣。盡管α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的提高已有多種策略，但不可逆變性的過(guò)程尚且未知，細(xì)菌α-淀粉酶穩(wěn)定性方面也還存在許多問(wèn)題。隨著高穩(wěn)定性芽孢桿菌α-淀粉酶的開發(fā)，未來(lái)α-淀粉酶工程很有可能由穩(wěn)定性向pH活性以及底物特異性方向轉(zhuǎn)變。由于對(duì)α-淀粉酶領(lǐng)域持續(xù)不斷的深入研究，這些理論和方法也將得到迅速發(fā)展，同時(shí)更好地應(yīng)用于構(gòu)建有著獨(dú)特性質(zhì)的α-淀粉酶，如通過(guò)修飾酶的遺傳特性或定點(diǎn)突變技術(shù)來(lái)獲得更多能滿足需要的嗜熱α-淀粉酶，同時(shí)將不同的酶熱穩(wěn)定性的提高策略進(jìn)行有機(jī)的整合也將體現(xiàn)出其特有的優(yōu)勢(shì)，能夠達(dá)到更理想的穩(wěn)定效果，也有助于對(duì)機(jī)理的深入研究。