UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中金剛烷胺的含量

江峰

帕金森?。≒arkinson disease，PD），是中老年常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，目前以藥物治療最為有效[1]。中國(guó)帕金森指南將金剛烷胺作為首選治療以震顫為主及年齡〈65歲的早期PD患者[2]。結(jié)合國(guó)情，金剛烷胺作為治療PD基藥[3]納入國(guó)家醫(yī)保甲類(lèi)目錄[4]。然其治療窗窄，過(guò)量致昏迷、死亡[5]，腎功能障礙者易蓄積中毒[6]，故應(yīng)開(kāi)展臨床用藥監(jiān)測(cè)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用LC-MS法，但存在局限性，如檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（≥6.5 min）、靈敏度低、樣本處理過(guò)程復(fù)雜、血漿用量較大等[7-10]。本實(shí)驗(yàn)建立一種快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便的UPLC-MS/MS法，旨在為臨床開(kāi)展治療藥物監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)探究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；Vortex-Genie 3多功能旋渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；HSC-12A恒溫槽（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；Herens Pico 21離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；AE-240電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；pHS-3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；Milli-Q5 超純水機(jī)（德國(guó)默克密理博公司）。

1.2 藥品和試劑

金剛烷胺（純度：97%，批號(hào)：MKBF8627V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鹽酸偽麻黃堿（內(nèi)標(biāo)純度：100%，批號(hào)：171237-200304）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司），二氯甲烷（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（德國(guó)默克密理博公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱(chēng)取金剛烷胺對(duì)照品2.33 mg，置于100 ml量瓶，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為23.3 μg·ml-1的金剛烷胺儲(chǔ)備液。將金剛烷胺儲(chǔ)備液稀釋200倍配成116.5 ng·ml-1金剛烷胺工作液，備用；精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品1.24 mg，置于100 ml量瓶，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為12.4 μl·ml-1的鹽酸偽麻黃堿儲(chǔ)備液。用超純水稀釋鹽酸偽麻黃堿儲(chǔ)備液，配制成2.5 μg·ml-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 色譜條件

采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動(dòng)相為0.01%甲酸水（A）—甲醇（B）。流速：0.25 ml·min-1；進(jìn)樣體積：5μl；柱溫為30 ℃。采用梯度洗脫，即0 min時(shí)，A：B=（80：20，v/v），1.5min 時(shí)，A：B=（10：90，v/v）2 min 時(shí)，A：B=（10：90，v/v），4 min 時(shí)，A：B=（80：20，v/v）。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源），多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式；金剛烷胺離子反應(yīng)為：m/z152.2→135.48；毛細(xì)管電壓3.7 kV，錐孔電壓35 V，碰撞能量16 eV；內(nèi)標(biāo)偽麻黃堿離子反應(yīng)：m/z166.29→148.29；毛細(xì)管電壓3.7 kV，錐孔電壓20 V，碰撞能量10 eV。

2.4 血漿樣品處理

取血漿樣品500 μl置10 ml玻璃離心管中，加入20 μl內(nèi)標(biāo)溶液（2.5 μg·ml-1），混合后加入2 ml二氯甲烷，渦旋混勻2 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液1.5 ml，40℃水浴中以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)? ml流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋3 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，1 μl進(jìn)樣。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng)考察 分別取5種不同來(lái)源的空白血漿500 μl，經(jīng)液液萃取N吹干后，加入流動(dòng)相配置的金剛烷胺和內(nèi)標(biāo)偽麻黃堿混合溶液（金剛烷胺濃度依次是1、150、600 ng·ml-1每個(gè)濃度各5 管），通過(guò)UPLC-MS/MS法分析，獲得峰面積，與相應(yīng)濃度混合對(duì)照品溶液峰面積之比評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果均在88%～100%之間，結(jié)果表明，本方法金剛烷胺及其內(nèi)標(biāo)的測(cè)定均不受基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取金剛烷胺工作液加入空白血漿中，配制成濃度為 0.7，2.8，7，28，70，140，280，700 ng·ml-1的含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按”2.4”處理后，再按“2.2”“2.3”條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖；以金剛烷胺濃度（x）為自變量，峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比（y）為應(yīng)變量，用加權(quán)（W=1/χ2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程：y=0.01261x+0.01737（r=0.997 3），結(jié)果表明，金剛烷胺在0.7～700 ng·ml-1范圍內(nèi)（r=0.997 3）有良好線性關(guān)系，定量下限為0.7 ng·ml-1。

2.5.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 空白血漿、含藥血漿樣品（含內(nèi)標(biāo)）和患者血漿樣品（含內(nèi)標(biāo)）分別按“2.2”“2.3”“2.4”方法考察血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及常規(guī)合并用藥是否干擾測(cè)定。所得色譜圖見(jiàn)圖1。金剛烷胺與內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間分別為2.14 min、1.00 min；二者能很好地分離，峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾金剛烷胺及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

圖1 金剛烷胺色譜圖

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果 （n=5）

表2 金剛烷胺穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.5.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿，配制金剛烷胺濃度分別為1、150、600 ng·ml-1的對(duì)照品血漿各5份，按“2.4”操作并進(jìn)行UPLC-MS分析，將結(jié)果與相應(yīng)濃度對(duì)照品水溶液結(jié)果比較，求算提取回收率及隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算方法回收率。同時(shí)，每種濃度樣品在一日內(nèi)平行操作測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度。同法每日操作測(cè)定1 次，連續(xù)5日，考察日間精密度。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2.5.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取空白血漿配制成1、150、600 ng·ml-1的含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份，考察樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明金剛烷胺經(jīng)過(guò)-20 ℃放置30 d，3次反復(fù)凍融，以及室溫放置3 d均穩(wěn)定。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

考察了水、0.01%甲酸和0.1%甲酸，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入甲酸可明顯增強(qiáng)待測(cè)物響應(yīng)，且0.01%甲酸效果優(yōu)于0.1%甲酸；恒速洗脫易使金剛烷胺峰形變寬，梯度洗脫可使峰形良好。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

通過(guò)考察偽麻黃堿對(duì)血漿中金剛烷胺測(cè)定的影響，結(jié)果表明用偽麻黃堿作內(nèi)標(biāo)其保留時(shí)間為1.0 min，而金剛烷胺保留時(shí)間為2.14 min，二者分離度達(dá)5.5，不會(huì)被其它雜質(zhì)干擾。

3.3 生物樣品處理方法的選擇

比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、乙醚-二氯甲烷（4：1）（v/v）[11]、環(huán)己烷、正戊烷對(duì)金剛烷胺的萃取效果，以二氯甲烷效果最好，可顯著減少雜質(zhì)干擾，且萃取回收率最高，故選其為萃取劑。血漿樣品處理參考了文獻(xiàn)[11-12]萃取劑、渦旋時(shí)間以及流動(dòng)相等并做改進(jìn)，分離效果良好。

3.4 標(biāo)曲范圍的選擇

本研究是為建立測(cè)定人血漿金剛烷胺血藥濃度方法學(xué)，通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，得金剛烷胺谷濃度范圍（529.73±86.49）ng·ml-1。故選取的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍足以用于臨床對(duì)金剛烷胺的監(jiān)測(cè)。

3.5 實(shí)驗(yàn)方法的選擇

金剛烷胺臨床給藥劑量較低，濃度測(cè)定靈敏度要求較高，故本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法，在3 min內(nèi)完成金剛烷胺的定量分析，提高工作效率。采用MRM模式，屏蔽其他成分的影響，并用內(nèi)標(biāo)法定量，極大地提高準(zhǔn)確性。

4 小結(jié)

本文建立了測(cè)定人血漿金剛烷胺血藥濃度UPLC-MS/MS 法，該法快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，可用于血藥濃度監(jiān)測(cè)以及藥動(dòng)學(xué)相關(guān)性研究。