淫羊藿中淫羊藿苷的高效液相色譜法測定含量

賈學(xué)忠

淫羊藿富含黃酮類化合物，可增加腦血流量，具有促造血功能、強化免疫及骨代謝和抗衰老等功效。淫羊藿苷為淫羊藿主要藥理成分，是一類黃酮類化合物，在人體內(nèi)分布極廣，并可通過血腦屏障。近年相關(guān)藥理研究多集中于該物質(zhì)在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及骨組織與泌尿生殖系統(tǒng)的作用機制等方面?，F(xiàn)已明確的是其對免疫系統(tǒng)有明顯調(diào)節(jié)作用，抗腫瘤作用等。我院將該藥物應(yīng)用于臨床，主要發(fā)揮其補腎陽、強筋骨的作用，研究方向以其成藥制劑治療男女不孕不育為主[1]。為控制制劑中有效成分含量，進一步把握和提升藥品質(zhì)量，筆者以高效液相色譜法測定制劑中淫羊藿苷含量?，F(xiàn)總結(jié)并報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)（含自動脫氣機、VWD檢測器）。

1.2 試藥

供含量測定的淫羊藿苷對照品（陜西帕尼爾生物科技有限公司生產(chǎn)，10 ml/包，批號0747-201511），本院淫羊藿苷制劑，色譜純?yōu)橐译妫绹鳷edia公司），水選取注射用水，分析純等。

2 方法

2.1 理化鑒定[2]

檢查黃酮類，準(zhǔn)確稱量藥物粉末0.1 g，加水10 ml，水浴10 min，濾過蒸干，加乙醇5 ml并熱溶，再次濾過。濾液中加鎂粉及濃鹽酸，顯紅色。準(zhǔn)確稱量藥物粉末0.5 g入甲醇10 ml，水浴溫浸30 min后濾過。濾液濃縮至1 ml留備供試品溶液。取淫羊藿苷對照品，甲醇溶解，制備l～2 mg/1 ml對照溶液。取2種溶液各10 μl，點于同一硅膠H薄層板，以10：1：1：1配比的醋酸乙酯—丁酮—85%甲酸—水展開，展距為15 cm。取出晾干，置于紫外分析燈（365 nm）下觀察，供試品與對照品在色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同暗紅斑點。1%AlCl3試液噴霧再次觀察，斑點呈現(xiàn)橙色。

2.2 含量測定

色譜條件：色譜柱ZorbaxSB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈—水（25：75，V/V），流速設(shè)定：1.0 ml/min；檢測波長的確立：取淫羊藿苷對照品適量，加50%乙醇溶液溶解，稀釋至1 mg/ml，50%乙醇溶液作為空白對照，于200～400 nm波長范圍中掃描，波長達270 nm時出現(xiàn)最大吸收[3]。計算理論塔板數(shù)≥2 500。準(zhǔn)確稱量對照品制備對照溶液，經(jīng)甲醇溶液溶解制備1 ml溶液，含淫羊藿苷34.5 μg。準(zhǔn)確稱取供試品0.2 g，研細(xì)置于錐形瓶（有塞）中，入50%乙醇溶液20 ml，經(jīng)功率200 W，頻率59 KHz超聲處理45 min，放置至室溫后稱重，不足則以50%乙醇溶液補足。搖勻過濾后精密量取4 ml水浴蒸干，加水（10 ml）溶解，以乙酸乙脂10 ml萃取3次，減壓回收溶劑至干，以50%乙醇溶液溶解殘渣，定容至25 ml，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量淫羊藿苷對照品10.40 mg，置于50 ml量瓶中，用50%乙醇溶液溶解稀釋成濃度為208.0 μg/ml的對照品儲備液。分別從中準(zhǔn)確抽取 0.6 ml、1.2 ml、1.8 ml、2.4 ml、3.0 ml、3.6 ml的溶液，置于25 ml量瓶中，分別用50%乙醇溶解稀釋，獲得系列濃度的對照品。準(zhǔn)確抽取對照品，各濃度各20 μl，注入液相色譜儀，依“2.2”中色譜條件測定峰面積。以淫羊藿苷進樣量作為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值作為縱坐標(biāo)，進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

3 結(jié)果

根據(jù)方程Y＝-5.953＋2107.944x，r＝0.999 8，提示淫羊藿苷于0.099 84～0.599 04 μg范圍內(nèi)存在良好線性關(guān)系。

3.1 陰性干擾試驗

按供試品溶液制備法制備淫羊藿苷陰性對照品溶液，濃度14.97 μg/ml。準(zhǔn)確抽取淫羊藿苷供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，依“2.2”中色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，淫羊藿苷于陰性無干擾處。

3.2 精密度實驗

準(zhǔn)確抽取淫羊藿苷對照品溶液（濃度14.97 μg/ml）20 μl，注入液相色譜儀，重復(fù)進樣5次，測定峰面積，RSD為1.03%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性實驗

取同供試品溶液20 μl，制備后分別于0、2、4、6、8 h測定峰面積，RSD為1.39%，測定所得結(jié)果顯示供試品溶液在8 h內(nèi)其淫羊藿苷穩(wěn)定性均良好。

3.4 重復(fù)性試驗

取同一份供試品，按同樣方法制備供試品溶液，抽取20 μl溶液，測定峰面積，結(jié)果RSD為2.92%。

3.5 加樣回收率試驗

精密稱取50 mg淫羊藿藥材粉末，分為6份，分別加入對照品溶液3個量各3份，按照供試品制備完成后對其含量予以測定，結(jié)果顯示淫羊藿定C及淫羊藿苷回收率分別為99.7%、102.5%，RSD分別為1.4%、1.1%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

4 討論

淫羊藿，小檗科植物莖葉，通常取自淫羊藿、心葉淫羊藿或箭葉淫羊藿，均為野生。少數(shù)附帶取其根莖與須根。別名：羊藿葉、仙靈脾、三枝九葉草。于陜西、四川、湖北及湖南多省的山林地帶[4]。其性溫味辛，歸于肝腎經(jīng)。具強筋骨，補肝腎及祛風(fēng)濕、助陽益精之臨床功效。多被施用于腰膝酸軟、風(fēng)寒濕痹、四肢麻木以及男科陽痿等病癥。淫羊藿的現(xiàn)代藥理研究顯示該藥：（1）可興奮性機能：相關(guān)動物實驗顯示，淫羊藿可促精液分泌，尤以葉、根藥效最佳，果實次之而莖部為最弱。（2）影響血小板凝集：大鼠體外實驗表明，淫羊藿可增加血小板聚集率；另有實驗證實，淫羊藿中的多糖成分可通過促進血小板的生成，而增強血小板聚集作用[5-7]。（3）降血壓：通過周圍血管舒張作用而降低血壓。（4）抗病毒：淫羊藿煎劑可直接滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及Sabin Ⅰ型。（5）影響骨代謝：大鼠實驗證實，淫羊藿還可預(yù)防去睪丸大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生。淫羊藿提取液不僅能夠抑制破骨細(xì)胞活性，又可改善骨細(xì)胞功能，使鈣化骨形成增加，骨形成大于骨吸收[8-10]。另外，淫羊藿對糖皮質(zhì)激素所引起的骨質(zhì)疏松有著良好的預(yù)防作用，聯(lián)用糖皮質(zhì)激素，可顯著抑制糖皮質(zhì)激素對骨質(zhì)的吸收。（6）對骨髓及造血系統(tǒng)的作用：研究證實，EPS可提高DNA合成率，影響核酸代謝，提高體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞增殖率，并能使疊氮胸苷所致的不良反應(yīng)（外圍血白細(xì)胞數(shù)目、骨髓造血干細(xì)胞和粒單系祖細(xì)胞數(shù)量減少，脾淋巴細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-2能力顯著降低）部分或全部消失[11-12]。提示EPS能促進骨髓造血，可試用于白血病的治療。

本研究中就高效液相色譜法測定供試品淫羊藿苷含量可行性進行實驗論證。結(jié)果顯示供試品淫羊藿苷在0.099 84～0.599 04μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好并無隱性干擾，供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。且本研究實驗中依照淫羊藿苷溶解性質(zhì)，經(jīng)乙酸乙脂多次提取、純化后可明顯減少供試品溶液中雜質(zhì)，確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。在使被測成分完全提取得到保證的同時降低了樣品對色譜柱的污染與干擾。此外，在本研究中，以乙腈—水（25：75，V/V）作為淫羊藿藥材含量測定相中的流動相，利于實驗獲得良好色譜分離效果。