苯并噻二唑處理提高低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖抗病性及機(jī)制分析

朱艷，陳富，李生娥，葛向珍，劉耀娜

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 30070；

3浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 130018

前言

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是我國(guó)主要的糧經(jīng)作物之一，年產(chǎn)量近8000萬(wàn)噸，約占總產(chǎn)量70%的塊莖采后需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期貯藏，以供應(yīng)翌年種薯及商品薯淡季銷售[1]。但是，馬鈴薯塊莖耐貯性差，由病原物侵染引起的侵染性病害是導(dǎo)致塊莖采后腐爛的重要原因，其中由鐮刀菌（Fusarium spp.）侵染引起的干腐病和細(xì)菌性軟腐病是導(dǎo)致塊莖窖藏期間腐爛的重要病害，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。目前，生產(chǎn)中主要通過(guò)低溫貯藏化結(jié)合學(xué)殺菌劑的使用來(lái)控制采后腐爛，然而，化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用，會(huì)產(chǎn)生殺菌劑殘留超標(biāo)、病原菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染等一系列問(wèn)題[4]。因此，尋求新型的、安全的、可替代或減少化學(xué)殺菌劑的病害防治方法十分必要。近年來(lái)，利用誘抗劑誘導(dǎo)植物自身抗病性的提高成為控制果蔬采后病害研究的熱點(diǎn)。

苯并噻二唑（benzothiadiazol, BTH)是水楊酸的結(jié)構(gòu)類似物，是第一個(gè)人工合成并商品化的誘抗劑，具有環(huán)境友好安全、誘抗效果廣譜、理化性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，其本身無(wú)抑菌活性，但可作為重要信號(hào)分子，誘導(dǎo)多種植物的抗病性，在控制植物病害方面具有重要作用[5]。研究表明，BTH不僅可有效減輕小麥、花椰菜、辣椒、黃瓜、甜瓜和番茄等多種作物的田間病害[6-9]，還可控制多種果蔬的采后病害[5]。采用BTH真空滲透可減輕鴨梨果實(shí)的青霉病和黑斑病以及芒果的炭疽病[10,11]；BTH浸泡處理可有效控制桃的青霉病[12]，并抑制甜瓜的黑斑病、白霉病和粉霉病[13]。在馬鈴薯中的研究發(fā)現(xiàn)，BTH處理可誘導(dǎo)馬鈴薯對(duì)瘡痂病的抗病性[14]，但鮮有BTH處理對(duì)馬鈴薯塊莖低溫貯藏中采后腐爛的控制效果及可能的抗病機(jī)理的報(bào)道。研究表明，植物抗病性的提高包括激活苯丙烷途徑，提高植物防御酶如β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase， GLU）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等活性[4,5]。因此，本研究采取不同濃度BTH采后噴施處理馬鈴薯塊莖，分析低溫貯藏期間BTH處理對(duì)塊莖干腐病和細(xì)菌性軟腐病的控制效果、抗病性相關(guān)酶活力及苯丙烷代謝相關(guān)產(chǎn)物含量的影響，以期為BTH在馬鈴薯塊莖采后低溫貯藏中病害防治的應(yīng)用提供參考。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)馬鈴薯為隴薯10號(hào)(Solanum tuberosum Longshu No.10)，于2016年10月采收于甘肅省渭源縣會(huì)川鎮(zhèn)，塊莖采后陽(yáng)光下晾曬2h，裝入網(wǎng)袋后當(dāng)天運(yùn)抵甘肅省農(nóng)科院會(huì)川試驗(yàn)站，于低溫（5±2℃，RH 75%～85%）的通風(fēng)庫(kù)中黑暗貯藏待用。

BTH (2,1,3-Benzothiadiazole) 為分析純，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 誘抗劑的制備

BTH 用0.01%Tween80（w/v）的無(wú)菌水配制，濃度分別為25、200ppm。

1.2.2 塊莖的處理

挑選通風(fēng)庫(kù)中外觀整齊，大小一致，無(wú)病蟲害，無(wú)機(jī)械傷的馬鈴薯塊莖，用2%（v/v）次氯酸鈉溶液浸泡2 min，進(jìn)行表面消毒后，在自來(lái)水下沖洗干凈并于庫(kù)內(nèi)自然晾干后，然后隨機(jī)將塊莖分為3組，每組塊莖90個(gè)，分別噴施25、200ppm的BTH溶液，使塊莖表皮均勻接觸BTH溶液，以噴施不加BTH的0.01%Tween80的無(wú)菌水為對(duì)照。塊莖晾干后裝入塑料網(wǎng)袋，立即入通風(fēng)庫(kù)貯藏。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 病情調(diào)查

分別于低溫下貯藏第90天和180天，進(jìn)行塊莖的病情調(diào)查。參照包改紅等[15的方法統(tǒng)計(jì)干腐病發(fā)病塊莖數(shù)及發(fā)病程度。以塊莖表面出現(xiàn)淺褐色水漬狀稍凹陷病灶，指壓后病組織可崩解判斷塊莖發(fā)生細(xì)菌性軟腐病病害。分別根據(jù)公式（1）計(jì)算干腐病及細(xì)菌性軟腐病的發(fā)病率，根據(jù)公式（2）計(jì)算兩種病害的病情指數(shù)。塊莖發(fā)生干腐病的嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下，0級(jí)：塊莖表面無(wú)干腐病癥狀；1級(jí)：塊莖表面有可視的輕度干腐病病斑；2級(jí)：10%～30%塊莖表面有病斑；3級(jí)：30%～50%塊莖表面有病斑；4級(jí)：大于50%塊莖表面有病斑。塊莖發(fā)生細(xì)菌性軟腐病的嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下，0級(jí)：塊莖表面無(wú)細(xì)菌性病害癥狀；1級(jí)：塊莖表面有可視的輕度水漬狀凹陷病斑；2級(jí)：10%～30%塊莖表面有水漬狀病斑；3級(jí)：30%～60%塊莖表面呈水漬狀病斑，薯塊軟化，指壓后組織崩解，薯肉灰白色；4級(jí)：大于60%塊莖表面呈水漬狀病斑，薯塊軟化，指壓后組織崩解，薯肉有膿狀物，有惡臭味。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

BTH處理后的塊莖，分別于低溫貯藏后第0、7、14、21、28和35天時(shí)，取塊莖皮下2-3mm處組織3.0g，液氮速凍后，在－80℃下冷凍保存待用。參考李雪等方法[16]，測(cè)定總酚、木質(zhì)素及PAL、PPO和POD的活性，參考劉曉佳等方法[17]，測(cè)定GLU和CHI的活性?？偡雍勘硎緸椤鱋D280nm· g-1 FW，木質(zhì)素含量以O(shè)D280· g-1 FW表示。PAL以每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每min使290nm波長(zhǎng)下吸光值變化0.05為一個(gè)酶活力單位（U）。POD以每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每min使470nm波長(zhǎng)下吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位（U）。PPO以每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每min使525nm波長(zhǎng)下吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位（U）。GLU以在37℃條件下，每mg組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖為1個(gè)酶活力單位（U）。CHI以在37℃條件下，每mg組織蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的量為1個(gè)酶活力單位（U）。單位均為U·mg－1protein。指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次

1.2.5 蛋白含量的測(cè)定

參照Bradford 的方法[18]，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算提取液中蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算采用Excel2007軟件，采用origin8.0進(jìn)行繪圖；數(shù)據(jù)的方差分析（ANOVA）采用SPSS 20.0軟件，利用Duncan’s多重比較對(duì)數(shù)據(jù)的顯著性差異進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2.結(jié)果與分析

2.1 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖干腐病的影響

圖1 BTH處理對(duì)低溫貯藏后馬鈴薯塊莖干腐病發(fā)病率(A)及干腐病病情指數(shù)(B)的影響

由圖1可知，馬鈴薯塊莖干腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大。與對(duì)照組相比，BTH處理均可顯著降低塊莖干腐病的發(fā)病率（圖1A）以及干腐病的病情指數(shù)（圖1B）。低溫貯藏后第90天，對(duì)照組干腐病發(fā)病率為33.33%，25ppm 和200ppm BTH處理組塊莖干腐病的發(fā)病率分別為12.67%和20.67%，分別較同期對(duì)照組降低了61.99%和37.98%，而低溫貯藏后第180天，對(duì)照組干腐病發(fā)病率上升至45.02%，25ppm和200ppm BTH 處理組塊莖干腐病的發(fā)病率分別為21.67%和33.89%，分別較同期對(duì)照組降低了51.87%和24.72%（圖1A）。低溫貯藏后第90天，對(duì)照組干腐病病情指數(shù)約為16.67，25ppm 和200ppm BTH處理組塊莖干腐病的病情指數(shù)顯著下降，分別為5.11和7.78，而低溫貯藏后第180天，對(duì)照組干腐病病情指數(shù)為38.33，25ppm和200ppm BTH 處理組塊莖干腐病病情指數(shù)分別為11.67和16.23，分別較同期對(duì)照組降低了69.55%和57.66%（圖1B）。

2.2 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖細(xì)菌性軟腐病的影響

如圖2所示，馬鈴薯塊莖細(xì)菌性軟腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，BTH處理可有效降低塊莖低溫貯藏中的細(xì)菌性軟腐病的發(fā)病率（圖2A）及病情指數(shù)（圖2B）。低溫貯藏后第90天，對(duì)照組細(xì)菌性軟腐病發(fā)病率為12.67%，25ppm 和200ppm BTH處理組塊莖細(xì)菌性軟腐病的發(fā)病率分別為2%和6.67%，分別較同期對(duì)照組降低了84.21%和47.36%，而低溫貯藏后第180天，對(duì)照組細(xì)菌性軟腐病發(fā)病率為22.33%，25ppm和200ppm BTH 處理組塊莖軟腐病的發(fā)病率分別較同期對(duì)照組降低了74.65%和34.30%（圖2A）。低溫貯藏后第90天，對(duì)照組細(xì)菌性軟腐病病情指數(shù)為4.44，25ppm 和200ppm BTH處理組塊莖軟腐病病情指數(shù)分別降至0.67和2.67，而低溫貯藏后第180天，對(duì)照組軟腐病病情指數(shù)為9.33，25ppm和200ppm BTH 處理組塊莖軟腐病病情指數(shù)分別為1.37和4.23，分別較同期對(duì)照組降低了85.33%和54.72%（圖2B）。

圖2 BTH處理對(duì)低溫貯藏后馬鈴薯塊莖細(xì)菌性軟腐病發(fā)病率(A)及細(xì)菌性軟腐病病情指數(shù)(B)的影響

2.3 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖抗性相關(guān)酶活力的影響

2.3.1 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖CHI和GLU活力的影響

如圖3A所示，在低溫貯藏期間，對(duì)照組馬鈴薯塊莖CHI活性逐漸降低， BTH處理顯著提高了塊莖中CHI的活性。BTH處理后，塊莖CHI的活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在貯藏期間，其活力始終高于對(duì)照組。如圖3B所示，在低溫貯藏早期，塊莖GLU的活力變化不大，但BTH處理后第14天，與對(duì)照組相比，25ppm BTH處理組塊莖GLU顯著升高，高于同期對(duì)照組酶活力的16.24%，200ppmBTH處理組塊莖GLU活力變化不大。

圖3 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖CHI(A)和GLU (B)活性的影響

2.3.2 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖PAL活力的影響

圖4 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖PAL活性的影響

如圖4所示，在低溫貯藏期間，馬鈴薯塊莖PAL活性逐漸升高，約在貯后第21天，達(dá)到一個(gè)高峰值后逐漸下降，BTH處理可提高塊莖PAL的活性。貯后第21天，與對(duì)照組相比，25ppmBTH處理組塊莖PAL活性可顯著高于對(duì)照組12.24%，而200ppmBTH處理組塊莖PAL活力變化不大。

2.3.3 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖PPO和POD活力的影響

圖5 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖PPO (A)和POD (B)活性的影響

由圖5A可知，與對(duì)照組相比，BTH處理可顯著增加塊莖中PPO的活力。在貯藏期間，對(duì)照組塊莖PPO活性逐漸下降，至處理后第21天下降至一個(gè)穩(wěn)定值后，基本保持平穩(wěn)。而BTH處理組塊莖PPO活力在處理后14天內(nèi)逐漸升高，后快速下降，在處理21天后又表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。但在整個(gè)貯藏期間，BTH處理組塊莖PPO活性始終高于對(duì)照組的酶活，且25ppmBTH處理組對(duì)塊莖酶活的提高水平稍高于200ppmBTH處理組的酶活。如圖5B所示，在塊莖貯藏期間，POD的活性呈先上升、后下降再上升、再下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，BTH處理可顯著提高塊莖POD的活性，且低濃度的BTH處理效果更好。在貯藏第7和28天，25ppm處理組塊莖POD活力分別較同期對(duì)照組高114%和136%。

2.4 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖總酚和木質(zhì)素的影響

圖6 BTH處理對(duì)低溫貯藏期間馬鈴薯塊莖總酚（A）及木質(zhì)素（B）含量的影響

由圖6A可知，對(duì)照組馬鈴薯塊莖總酚的含量在貯后7天內(nèi)快速下降，之后升高，至第14天達(dá)到一個(gè)高峰后下降，呈先下降、后上升再下降的趨勢(shì)。BTH處理可緩解塊莖中總酚含量的下降趨勢(shì)，使其含量始終高于對(duì)照組。在處理后第7天，25ppmBTH和200ppm處理組塊莖總酚含量分別高于同期對(duì)照組28.91%和7.81%。在處理后第14天，25ppmBTH和200ppm處理組塊莖總酚含量分別高于同期對(duì)照組14.42%和7.21%。低溫貯藏期間，馬鈴薯塊莖木質(zhì)素的含量逐漸升高，與對(duì)照組相比，BTH處理顯著可提高塊莖中木質(zhì)素的含量 (圖6B)。在處理后第7天，25ppmBTH和200ppm處理組塊莖木質(zhì)素含量分別高于同期對(duì)照組19.48%和4.03%。整個(gè)貯藏期，BTH處理組塊莖木質(zhì)素含量均高于對(duì)照組，且，25ppm BTH處理組塊莖木質(zhì)素含量水平高于200ppmBTH處理組木質(zhì)素含量（第14天除外）。

3.討論

作為水楊酸的類似物，BTH可誘導(dǎo)多種果蔬的采后抗病性，降低采后病害的發(fā)生[4]。而真菌性病害以及細(xì)菌性病害是引起馬鈴薯塊莖貯藏中腐爛的主要病害，尤以干腐病[2]和細(xì)菌性軟腐病引起的危害為重[3]。本研究結(jié)果表明，BTH采后噴施處理可顯著減輕馬鈴薯塊莖在低溫貯藏期間干腐病和細(xì)菌性軟腐病的嚴(yán)重程度，該結(jié)果與前人發(fā)現(xiàn)BTH處理可有效控制桃果實(shí)貯藏期間的青霉病發(fā)病率和杧果果實(shí)自然發(fā)病的病情指數(shù)等[19,20]結(jié)果基本相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，BTH誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖抗病性的提高具有濃度效應(yīng)，低濃度的BTH處理效果優(yōu)于高濃度水平。

GLU和CHI具有降解真菌細(xì)胞壁中的β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的作用，是植物防衛(wèi)反應(yīng)中重要的病程相關(guān)蛋白，植物被誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩種酶，則通常被認(rèn)為能夠增強(qiáng)對(duì)病原菌的抗病性[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BTH處理可提高馬鈴薯塊莖的抗病性防御酶GLU、CHI的活力，這與前人在研究BTH 處理可誘導(dǎo)柑橘和砂糖橘果實(shí)中GLU和CHI活性提高的結(jié)果[17,22]基本相符。PAL、POD、PPO參與了植物苯丙烷代謝和木質(zhì)素等代謝過(guò)程，PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，該途徑的主要產(chǎn)物是多種酚類物質(zhì)，不僅可抑制病原菌侵染植物，又是合成細(xì)胞壁中木質(zhì)素的前體，總酚和木質(zhì)素含量的增加，使植物對(duì)病原菌的抗性增強(qiáng)[23]。PAL、POD、PPO對(duì)增強(qiáng)對(duì)植物抗病性具有重要作用。已有研究表明，BTH處理能夠促進(jìn)相關(guān)果蔬中PAL、POD、PPO活力的增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)其抗病性[4,23]。本研究結(jié)果表明，BTH噴施處理后，塊莖PAL、PPO和POD的活性被顯著提高，并促使塊莖內(nèi)總酚和木質(zhì)素等抗病性物質(zhì)的積累。推測(cè)BTH通過(guò)誘導(dǎo)GLU、CHI、PAL、POD和PPO活力的增強(qiáng)，促進(jìn)酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累，增強(qiáng)馬鈴薯塊莖抵抗病原菌侵染的抗性反應(yīng)。