不同品種烤煙根際微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究

李 強(qiáng)，孫敬釗，皮本陽(yáng)，黃文華，孔午圓，陳 蘇，賀 非

(常德市煙草公司臨澧縣分公司，湖南常德 415000)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤的形成發(fā)育、物質(zhì)循環(huán)、肥力演變以及植物生長(zhǎng)等方面有極其重要的作用[1-2]。近年來，隨著土地復(fù)種指數(shù)的提高，以及長(zhǎng)期過量施用化肥和農(nóng)藥，導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境不斷惡化，土壤板結(jié)、微生物種群結(jié)構(gòu)趨劣、煙草病蟲害發(fā)病率不斷上升、煙葉品質(zhì)下降等問題愈發(fā)嚴(yán)重[3-6]。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中探究土壤微生物多樣性變化以及微生物群落結(jié)構(gòu)特征，對(duì)保障作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、推動(dòng)煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

云煙99、云煙87、云煙97和K326是湖南省濃香型特色烤煙主栽品種，前人對(duì)其產(chǎn)量、煙葉品質(zhì)、生長(zhǎng)發(fā)育等方面研究較多[7-10]，但不同烤煙品種根際微生態(tài)環(huán)境之間有何差異，目前鮮見報(bào)道。因此，筆者通過小區(qū)試驗(yàn)，研究不同品種烤煙根際微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異，以期為改善烤煙根際土壤微生態(tài)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況于2015、2016年在湖南省常德市臨澧縣進(jìn)行試驗(yàn)，土壤類型為黏壤土。0～20 cm耕作層土壤pH 5.9，有機(jī)質(zhì)16.8 g/kg，堿解氮114.19 mg/kg，速效磷18.42 mg/kg，速效鉀134.46 mg/kg。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)品種處理：云煙99(Y99)、云煙87(Y87)、云煙97(Y97)、K326，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，各小區(qū)面積30 m2，每小區(qū)種50株烤煙，行距120 cm，株距50 cm。區(qū)組設(shè)通道，四周設(shè)保護(hù)行。

1.3取樣及分析方法各品種烤煙于2015年4月10日、2016年4月12日移栽，在烤煙旺長(zhǎng)期，即2015年6月11日、2016年6月13日采集根際土壤。按小區(qū)5點(diǎn)取樣法選取5株烤煙，采用抖土法，先輕輕抖落大塊不含根系的非根際土壤，然后輕輕剝離根系表面附著的土壤，獲取根際土壤后，用4分法取適量于無菌袋中立即帶回實(shí)驗(yàn)室。采用Biolog-Eco微平板方法[11]測(cè)定土壤微生物代謝功能多樣性。

1.4指標(biāo)計(jì)算方法采用平均顏色變化率(average well color development，AWCD)描述土壤微生物群落的代謝活性；采用Shannon多樣性指數(shù)(H)、Mcintosh均一性指數(shù)(U)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)表征土壤微生物群落多樣性。各指標(biāo)計(jì)算公式[12-13]：

AWCD=∑(Ci-R)/n，式中，Ci、R分別為反應(yīng)孔、對(duì)照孔在590 nm下的吸光度，n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

H= -∑(Pi×lnPi)，式中，Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比值。

D=1-∑(Pi×Pi)，式中，Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比值。

碳源利用率為整個(gè)培養(yǎng)過程中該類碳源相對(duì)吸光值之和與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率。

1.5數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行處理；采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析、主成分分析，差異顯著性分析采用Duncan新復(fù)極差方法，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1不同品種烤煙根際微生物群落代謝活性AWCD是評(píng)價(jià)微生物對(duì)碳源利用能力的一個(gè)重要指標(biāo)，反映了土壤微生物的代謝活性，AWCD值越大，代謝活性越高[14]。由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種根際微生物AWCD值呈先不斷增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在培養(yǎng)起始的24 h內(nèi)，各處理AWCD值均較低，說明此時(shí)根際微生物群落代謝活性較低，碳源基本未利用；在24 h后，AWCD值急速上升，表明微生物代謝活躍，碳源開始被大量利用；2015年根際微生物AWCD值在168 h趨于平緩，2016年根際微生物AWCD值在144 h趨于平緩，說明此時(shí)微生物活性達(dá)到穩(wěn)定?？傮w上，AWCD值整體表現(xiàn)為K326>Y97>Y87>Y99，說明K326根際微生物群落代謝活性最高，云煙99(Y99)根際微生物群落代謝活性最低。

圖1 根際微生物AWCD的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 AWCD dynamics of rhizospheric microorganisms

2.2不同品種烤煙根際微生物碳源利用偏好土壤微生物活性反映了群落總體的變化，但未反映微生物群落代謝詳細(xì)信息，研究土壤微生物對(duì)碳源的利用偏好，有助于更加全面地了解微生物群落代謝功能特性。根據(jù)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑的不同，將Biolog-ECO微孔板上31種底物碳源分為6類：碳水化合物、羧酸類、氨基酸類、胺類、聚合物、酚酸類；利用AWCD值分別計(jì)算出2015和2016年不同碳源的利用率，然后得出2年試驗(yàn)的平均利用率，用以表征根際微生物對(duì)碳源的利用偏好。

由圖2可知，Y99、Y87、Y97、K326根際微生物對(duì)6類碳源的利用情況有一定差異，碳源利用率總體以碳水化合物、羧酸類、氨基酸類較高。其中Y99根際微生物對(duì)羧酸類碳源利用最多，平均利用率為22.1%，對(duì)酚酸類利用最少，平均利用率僅為8.3%。Y87、Y97、K326根際微生物利用最多的均是碳水化合物，平均利用率分別為21.4%、20.3%、19.7%，利用最少的均是酚酸類，平均利用率分別為9.7%、9.5%、13.1%。由此可知，Y99根際微生物偏好羧酸類碳源，而Y87、Y97、K326根際微生物偏好碳水化合物碳源。

圖2 不同品種烤煙根際微生物對(duì)碳源利用率Fig.2 Carbon source utilization rate by rhizospheric microorganisms of different varieties of flue-cured tobacco

2.3不同品種烤煙根際微生物碳源利用的主成分分析為了進(jìn)一步探討4個(gè)不同品種烤煙，其根際微生物碳源利用方式的差異，將根際微生物120 h測(cè)定的AWCD值進(jìn)行主成分分析，并根據(jù)微生物對(duì)各類碳源利用的因子權(quán)重值，分析不同品種烤煙根際微生物群落多樣性的變化。在2015和2016年的試驗(yàn)中，均提取了5個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率分別達(dá)94.1%、95.8%，第1主成分(PC1)貢獻(xiàn)率分別為59.5%、64.1%，第2主成分(PC2)貢獻(xiàn)率分別為12.3%、12.4%。因第3～5個(gè)主成分貢獻(xiàn)率較小，因此取前2個(gè)主成分進(jìn)行重點(diǎn)分析。

選取PC1和PC2的得分做圖來表征微生物群落碳源代謝特征。由圖3可知，2015和2016年試驗(yàn)結(jié)果均顯示，Y87、Y97、K326在PC1的得分均為正值，根際微生物群落碳源利用特征相似，而Y99得分值為負(fù)值，表明PC1的碳源是區(qū)分Y99與其他3個(gè)品種間差異的敏感碳源；Y99、Y87、K326在PC2的得分均為正值，根際微生物群落碳源利用特征相似，而Y97得分值為負(fù)值，表明PC2的碳源是區(qū)分Y97與其他3個(gè)品種間差異的敏感碳源。

碳源載荷值反映了碳源利用與主因子的相關(guān)性，載荷值越高，表示其對(duì)主成分的影響越大[15]。由表1可知，2015年試驗(yàn)中，與PC1相關(guān)性較高(載荷值>0.6)的碳源有26種，其中碳水化合物9種，羧酸類7種，氨基酸類5種，聚合物和胺類均為2種，酚酸類1種；與PC2相關(guān)性較高的碳源有3種：β-甲基D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸、L-苯基丙氨酸，分別屬于碳水化合物、羧酸類、氨基酸類。由圖3可知，碳水化合物、羧酸、氨基酸是區(qū)分云煙99(Y99)與其他3個(gè)品種間差異的敏感碳源。

2016年試驗(yàn)中，與PC1相關(guān)性較高的碳源有28種，其中碳水化合物9種，羧酸類7種，氨基酸類6種，聚合物、酚酸類、胺類均為2種；與PC2相關(guān)性較高的碳源有2種：a-丁酮酸、肝糖，分別屬于羧酸類、聚合物。碳水化合物、羧酸、氨基酸是區(qū)分Y99與其他3個(gè)品種間差異的敏感碳源，這與2015年試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis

碳源類型Carbon source type底物Substrates2015年P(guān)C1PC22016年P(guān)C1PC2碳水化合物D-甘露醇D-Mannitol0.966 0.844 Carbonhydratesa-D-乳糖a-D-Lactose0.925 0.710 丙酮酸甲脂Pyruvic Acid Methyl Ester0.840 0.942 I-赤藻糖醇I-Erythritol0.802 0.875 D-纖維二糖D-Cellobiose0.754 0.855 葡萄糖-1-磷酸鹽Glucose-1-Phosphate0.753 0.699 D-木糖D-Xylose0.736 0.623 β-甲基D-葡萄糖β-Methyl-D-Glucoside0.726 0.601 0.661 N-乙?；?D-葡萄胺N-Acetyl-D-Glucosamine0.634 0.863 羧酸類a-丁酮酸a-Ketobutyric Acid0.865 0.746 0.603Carboxylic acidsD-葡萄胺酸D-Glucosaminic Acid0.860 0.929 D-蘋果酸D-Malic Acid0.843 0.846 衣康酸Itaconic Acid0.801 0.823 D-半乳糖內(nèi)酯D-Galactonic Acid y-Lactone0.760 0.768 y-羥基丁酸y-Hydroxybutyric Acid0.675 0.601 D-半乳糖醛酸D-Galacturonic Acid0.613 0.614 0.817 D,L-a-甘油D,L-a-Glycerol氨基酸類L-天冬酰胺酸L-Asparagine0.920 0.959 Amino acidsL-絲氨酸L-Serine0.859 0.959 L-精氨酸L-Arginine0.854 0.815 L-蘇氨酸L-Threonine0.809 0.847 甘氨酰-L-谷氨酸Glycyl-L-Glutamic Acid0.800 0.898 L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine0.790 0.815 聚合物吐溫80 Tween 800.911 0.905 Polymers吐溫40 Tween 400.910 0.954 肝糖Glycogen0.676a-環(huán)式糊精a-Cyclodextrin0.637 酚酸類4-羥基苯甲酸4-Hydroxy Benzoic Acid0.887 0.919 Phenolic acids2-羥基苯甲酸2-Hydroxy Benzoic Acid胺類苯乙基胺Phenylethyl-amine0.814 0.863 Amines腐胺Putrescine0.634 0.727

2.4不同品種烤煙根際微生物群落功能多樣性指數(shù)不同多樣性指數(shù)可以從不同方面來描述微生物群落的多樣性，多樣性指數(shù)越大，微生物群落功能多樣性越高[16]。其中Shannon多樣性指數(shù)用來表征生態(tài)系統(tǒng)中的物種及其個(gè)體數(shù)；Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)反映群落中優(yōu)勢(shì)種群的數(shù)量；Mcintosh均一性指數(shù)用來描述群落中個(gè)體分布的均勻情況[17-18]。

由表2可知，不同品種烤煙，根際微生物群落多樣性指數(shù)存在一定差別。各處理Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)在2年的試驗(yàn)中均無顯著變化，可見不同品種烤煙之間根際微生物種類和優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量無顯著差異。Mcintosh指數(shù)在2年試驗(yàn)中均表現(xiàn)為K326>Y97>Y87>Y99的規(guī)律，且各處理間存在顯著差異；其中K326的根際微生物Mcintosh指數(shù)最大，平均為7.652，Y99最小，平均為5.588，前者是后者的1.37倍。綜合而言，不同品種的烤煙，其根際微生物種類和優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量并無差異，但微生物種群的分布情況存在顯著差異，尤以K326根際微生物群落物種分布最均勻。

表2根際微生物群落多樣性指數(shù)

Table2Diversityindicesofrhizosphericmicroorganismscommunities

年份Test year品種CulticarShannon 指數(shù) Shannon index(H)Mcintosh 指數(shù) Mcintosh index(U)Simpson 指數(shù)Simpson index(D)2015Y993.119 a5.704 d0.949 aY873.134 a6.391 c0.954 aY973.274 a7.221 b0.959 aK3263.244 a7.661 a0.957 a2016Y993.158 a5.472 d0.952 aY873.253 a6.312 c0.957 aY973.273 a7.130 b0.959 aK3263.169 a7.643 a0.954 a

注：同列不同小寫字母表示不同品種間差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercases in the same column stand for significant differences between different varieties at 0.05 level

3 結(jié)論與討論

微生物對(duì)碳源利用能力可以反映微生物群落代謝活性水平。王戈等[19]通過研究云85、K326、凈葉黃、紅花大金元4種烤煙根際微生物數(shù)量及多樣性的差異，發(fā)現(xiàn)不同品種烤煙根際微生物對(duì)碳源總體利用能力存在一定差異，其中云85根際微生物群落代謝活性最高。該研究結(jié)果表明，根際微生物群落代謝活性表現(xiàn)為K326>Y97>Y87>Y99，K326根際微生物群落代謝活性最高，云煙99根際微生物群落代謝活性最低。

根際土壤微生物對(duì)碳水化合物、羧酸類、氨基酸類、胺類、聚合物和酚酸類6類碳源的利用率在一定程度上反映微生物的群落結(jié)構(gòu)。蔡秋華等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在尋甸試驗(yàn)點(diǎn)，不同品種對(duì)碳源的利用率表現(xiàn)為K326>云煙87>紅花大金元；在石林試驗(yàn)點(diǎn)，利用率則表現(xiàn)為紅花大金元>K326>云煙87。該研究結(jié)果表明，云煙99根際微生物對(duì)羧酸類碳源利用最多，而云煙87、云煙97、K326根際微生物對(duì)碳水化合物碳源利用最多。

主成分分析結(jié)果表明，云煙87、云煙97、K326得分值集中分布在PC1正半軸，而云煙99則位于PC1負(fù)半軸；碳水化合物、羧酸類、氨基酸類這3類碳源在PC1上相關(guān)性較高，綜合分析認(rèn)為，云煙87、云煙97、K326偏好碳水化合物、羧酸類、氨基酸類物質(zhì)。

許玲[21]通過分析12個(gè)不同品種烤煙節(jié)肢動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)豫煙6號(hào)的多樣性、均勻度、優(yōu)勢(shì)集中性都較高，Y8324各群落特征指數(shù)較低。該研究結(jié)果表明，不同品種的烤煙，其根際微生物種類(Shannon指數(shù))和優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量(Simpson指數(shù))并無差異，Mcintosh指數(shù)在2年的試驗(yàn)中均表現(xiàn)為K326>Y97>Y87>Y99的規(guī)律，表明K326根際微生物群落物種分布最均勻。