微生物修復(fù)及油污土壤改良研究

王曙光，穆 馳，林兆豐

(陜西省土地工程建設(shè)集團(tuán)，陜西西安 710075)

石油被稱為工業(yè)的血脈，是我國現(xiàn)代化進(jìn)程的重要能源之一[1]。然而，隨著石油使用量的增加，各種泄露事故造成的環(huán)境污染在石油的勘探、開采、運(yùn)輸過程中越來越嚴(yán)重[2]。研究表明，全球每年約有500萬t的石油污染物進(jìn)入環(huán)境，每年約有60萬t石油污染衍生物進(jìn)入環(huán)境[3]。這些石油污染物以不同的渠道進(jìn)入土壤，降低土壤透氣性，改變土壤結(jié)構(gòu)，影響微生物種群，減少農(nóng)作物產(chǎn)量[4-7]。污染土壤中石油主要成分為C15～C36的烷烴及苯系物酚類等，其中30多種污染物受環(huán)境優(yōu)先控制[8]。

微生物修復(fù)技術(shù)是在人工增強(qiáng)條件下，使用天然微生物或者人造微生物起主導(dǎo)作用的一種方法。通過人為因素，將外來微生物添加到油污土壤，降解并去除土壤中烴類化合物[9-10]。相比傳統(tǒng)方法，微生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、種類多、易變異等特點(diǎn)，同時，使用微生物修復(fù)技術(shù)不會破壞土壤環(huán)境，保障生態(tài)環(huán)境的完整性。

通過改變外部環(huán)境的溫度、濕度、通氣量、營養(yǎng)物質(zhì)及微生物表面活化性，可以實現(xiàn)油污土壤受損修復(fù)[11-13]。借助微生物修復(fù)技術(shù)，接種高效降解菌株或者微生物群體，可以提高土壤中石油的降解率，但微生物修復(fù)技術(shù)對于難降解的復(fù)雜化合物(瀝青、石蠟等)和油污土壤難以適用，該方面技術(shù)還需深入研究[14-15]。

1 油污土壤微生物修復(fù)機(jī)理

石油烴是高分子的復(fù)雜混合物，由鏈烷烴、芳香烴、環(huán)烷烴組成。鏈烷烴的代謝機(jī)制是氧化作用和脫烴作用，通過酶的氧化作用將鏈烷烴進(jìn)行降解，鏈烷烴經(jīng)過酶化作用轉(zhuǎn)換成伯醇，經(jīng)由丙醛轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的脂肪酸，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)并分解成CO2和H2O，或進(jìn)入其他轉(zhuǎn)換過程[16-17]。環(huán)烷烴通過還原反應(yīng)可形成烯烴，烯烴通過進(jìn)一步脫氫作用形成伯醇和丙醛，兩者相互作用形成脂肪酸；或者由過氧化作用直接轉(zhuǎn)化成脂肪酸。一些微生物還可以通過氧化作用形成伯醇，并進(jìn)一步氧化分解。同時，部分微生物通過脫氫作用成為不飽和脂肪酸，并形成某些脂肪酸帶有末端氫鍵，該類烴化脂肪酸降解能力強(qiáng)。土壤退化中后期細(xì)菌的生長情況見圖1、2。

圖1 土壤退化中期細(xì)菌生長情況Fig.1 Bacteria growth in the mid-degradation of soil

圖2 土壤退化后期細(xì)菌生長情況Fig.2 Bacteria growth in the late stage of soil degradation

環(huán)烷烴屬于難降解烴類。環(huán)烷烴的端部沒有氫鍵，其生化原理與烷烴端部氫化原理相似，并通過氧化酶氧化功能生成烷醇，然后脫氫為酮并進(jìn)一步氧化成內(nèi)酯或者直接轉(zhuǎn)化為脂肪酸[18-20]。笨和短鏈烷基被脫氫酶和氧化還原酶代謝成為鄰苯二酚和甲基二酚，后者可以在鄰位或者間位斷裂形成羧酸。

多環(huán)芳烴(PAHs)的降解首先由微生物產(chǎn)生的氧化酶進(jìn)行，產(chǎn)物相互作用進(jìn)行定位氧化。環(huán)氧化物由真菌被單加酶氧化所形成，再加入H2O產(chǎn)生醇和醛，將氧原子加到2個末端的苯環(huán)上，生化為過氧化物。通過物質(zhì)之間相互反應(yīng)形成的代謝產(chǎn)物，一方面可被生物合成用于微生物成分，另一方面可氧化成碳水化合物[21-22]。

2 油污土壤微生物修復(fù)影響因素分析

2.1微生物種類和菌群特性微生物不僅是石油降解的執(zhí)行者，而且是微生物修復(fù)的核心力量，研究表明，混合菌株降解石油的效果明顯高于單獨(dú)菌株。Hamme等[23]通過混合菌株培養(yǎng)試驗，結(jié)果表明，混合培養(yǎng)菌株可明顯提高油脂的降解率；魏偉[24]通過設(shè)置不同復(fù)合鹽濃度篩選微生物混合菌株，結(jié)果表明，混合培養(yǎng)的菌株可明顯增加石油降解效果；于齊等[25]采集陜北典型石油污染土壤，施入19種常見城市綠化樹木枯落葉粉碎樣，進(jìn)行混合分解培養(yǎng)試驗，并以主要成分層次分析法進(jìn)行綜合評價。

2.2表面活性劑在石油烴的生物降解期間，烴的溶解度直接影響微生物降解速率。當(dāng)濃度極低時，碳?xì)浠衔锸强扇艿模蟛糠忠绯鰜淼挠椭h(yuǎn)大于其溶解限度，通過在微生物表面加入化學(xué)合成的表面活化劑可解決上述問題。微生物表面活化劑具有易降解、毒害低、對周圍環(huán)境超強(qiáng)適應(yīng)性等特點(diǎn)成為材料化學(xué)和分子物理研究的熱點(diǎn)。微生物表面結(jié)構(gòu)特性不同會產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的表面活化劑，主要是磷脂、脂質(zhì)、脂肪酸和中性脂肪酸等。研究表明，微生物表面活化劑對石油烴類有明顯降解作用。

2.3系統(tǒng)環(huán)境由于石油構(gòu)造成分復(fù)雜，因此微生物對油脂降解能力不盡相同，環(huán)境因素對石油烴類降解具有影響，這種影響通常對石油降解起關(guān)鍵作用。石油碳?xì)浠衔锟梢栽诃h(huán)境中長時間存在，而在另一個環(huán)境中，相同的碳?xì)浠衔锟梢栽跀?shù)天或者數(shù)小時內(nèi)完全降解。①土壤pH。像大多數(shù)微生物一樣，能夠降解石油物質(zhì)的土壤微生物pH為6.0～8.0，優(yōu)選7.0～7.5。在微生物降解過程中，由于長期影響產(chǎn)生的酸性物質(zhì)在土壤中積累，導(dǎo)致土壤pH逐漸下降，引起土壤酸化，在被污染的酸性土壤中，為了增強(qiáng)微生物活化性能和提高石油烴類降解速率，一些農(nóng)業(yè)酸堿緩沖劑可添加到土壤中，調(diào)節(jié)土壤的酸堿性。因此，土壤最適pH與降解菌種和降解環(huán)境有關(guān)。②土壤溫度。土壤溫度通過影響石油的物理性質(zhì)和化學(xué)組成影響微生物的碳?xì)浠衔锎x率。在溫度較低的環(huán)境下，隨著油黏度增加，烷烴末端有毒的短鏈作用揮發(fā)減弱，且烷烴水溶性加大，對微生物的毒性也增加，這將間接影響碳?xì)浠衔锏纳锝到饴?，?dāng)溫度降低時，酶活性降低，導(dǎo)致降解速率降低。較高的溫度可以使碳?xì)浠衔锏拇x率最大化，通常為30～40 ℃。③供氧狀況。環(huán)境中的氧氣是微生物極其重要的限制因素，石油的微生物降解過程因碳?xì)浠衔锒?，但好氧微生物降解的初始反?yīng)類似，在微生物降解過程中，需要尋找大量的帶電粒子，主要溶解土壤的含氧量和負(fù)離子，由于油脂會在表面形成一層油膜，降低氧氣在土壤中的傳遞速率，在石油污染區(qū)，供氧不足已成為制約土壤中石油降解的主要因素。④土壤中營養(yǎng)成分。微生物的生長環(huán)境離不開必要的無機(jī)因素，但土壤環(huán)境提供的營養(yǎng)成分是有限的，石油中的烴類可以提供土壤必要的有機(jī)物，但不能提供氮、磷、硫、鎂等無機(jī)元素，因此該類無機(jī)養(yǎng)料是限制微生物活性的重要因素。為了降低土壤中的石油含量，提高土壤油脂降解率，需要在土壤中適當(dāng)添加營養(yǎng)成分，促進(jìn)石油烴類生物降解。⑤鹽濃度。低濃度的鹽類(NaCl、KCl、MgSO4等)對土壤中微生物生長具有促進(jìn)作用，但濃度過高時，會抑制微生物生長，同時溶液中NaCl濃度對細(xì)胞膜上的Na+、K+泵有很大影響，而Na+、K+泵維持的細(xì)胞內(nèi)外離子梯度具有重要的生理學(xué)意義，它不僅維持細(xì)胞的膜電位，也調(diào)節(jié)細(xì)胞的體積和驅(qū)動某些細(xì)胞中糖與氨基酸的運(yùn)輸，從而影響細(xì)胞的生長。

3 不同條件對混合菌劑降解率的影響

3.1培養(yǎng)時間根據(jù)1∶1混合培養(yǎng)的2種菌劑，每100 mL篩選培養(yǎng)基0.5 mL，在30 ℃、110 r/min下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后第2、3、4、5、6和7天測定，計算每種混合菌劑的油污降解率。從圖3可以看出，混合菌劑1#在培養(yǎng)初期的降解率非常低，第2天降解率為28.10%，混合菌劑2#為32.89%；降解率從第3天開始明顯增加，第5天混合菌劑1#的降解率為59.73%，混合菌劑2#為73.31%。隨著培養(yǎng)時間的延長，2種混合微生物菌劑對石油的降解速率逐漸變慢。第7天，混合菌劑1#對油污的降解率為70.10%，混合菌劑2#的降解率為81.23%。這說明隨著培養(yǎng)時間的延長，油脂去除率越高，去除效果越好，在設(shè)定的培養(yǎng)條件下，混合菌劑2#石油降解率顯著高于混合菌劑1#。因此，采用7 d為適宜的培養(yǎng)時間。

3.2培養(yǎng)溫度根據(jù)1∶1混合培養(yǎng)的2種菌劑，每100 mL篩選培養(yǎng)基0.5 mL，分別置于溫度15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下100 r/min密閉培養(yǎng)，經(jīng)過7 d振蕩培養(yǎng)后，測量培養(yǎng)基中油脂含量，并計算每種溫度培養(yǎng)下石油的降解率。從圖4可以看出，培養(yǎng)溫度對混合菌劑2#的影響遠(yuǎn)大于混合菌劑1#。在溫度15 ℃培養(yǎng)7 d后，混合菌劑1#石油降解率為32.59%，混合菌劑2#石油降解率為24.19%，在該溫度條件下，混合菌劑1#石油降解率顯著高于混合菌劑2#。當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高時，混合菌劑2#的降解速率呈線性增加，而混合菌劑1#的降解速率增加緩慢。當(dāng)培養(yǎng)溫度設(shè)定為35 ℃時，混合菌劑1#對石油的降解率最大，隨著溫度繼續(xù)升高，降解率逐漸下降；當(dāng)培養(yǎng)溫度設(shè)定為33 ℃時，混合菌劑2#對石油的降解率達(dá)到最大，降解率為78.69%，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，其降解率也隨之下降。這說明培養(yǎng)溫度對2組混合菌劑石油降解率均有影響，當(dāng)培養(yǎng)時間7 d、菌劑接種量0.5 mL時，混合菌劑1#的最適培養(yǎng)溫度為35 ℃，混合培養(yǎng)菌劑2#最適培養(yǎng)溫度為33 ℃。

圖3 培養(yǎng)時間對不同混合菌劑降解率的影響Fig.3 Effect of culture time on degradation rate of different mixed bacteria

圖4 培養(yǎng)溫度對不同混合菌劑降解率的影響Fig.4 Effect of culture temperature on degradation rate of different mixed bacteria

3.3培養(yǎng)基pH設(shè)定混合菌劑培養(yǎng)基的pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0共9個水平。根據(jù)1∶1混合培養(yǎng)的2種菌劑，每100 mL篩選培養(yǎng)基0.5 mL，分別放置于溫度35 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，將培養(yǎng)基放置7 d，并測定培養(yǎng)基中石油含量和混合菌劑對石油的降解率。從圖5可以看出，當(dāng)初始pH為5.0～7.0時，混合菌劑1#石油降解率顯著高于混合菌劑2#，當(dāng)初始pH為7.0～9.0時，混合菌劑2#石油降解率顯著高于混合菌劑2#，對于混合菌劑1#，在初始pH為5.0～7.5時，其降解率隨著初始pH的升高而升高，在初始pH為7.5時降解率達(dá)到最大值70.24%，之后隨著初始pH的升高，降解率呈直線下降趨勢；對于混合菌劑2#，在初始pH為5.0～8.0時，其降解率隨著初始pH的升高而升高，在初始pH為8.0時降解率達(dá)到最大值80.10%，之后隨著初始pH的升高，降解率呈明顯下降趨勢。這說明培養(yǎng)基pH不同對2組混合菌劑石油降解率有較大影響，當(dāng)培養(yǎng)時間為7 d，菌劑接種量為0.5 mL，混合培養(yǎng)菌劑的最適培養(yǎng)溫度為35 ℃時，混合菌劑1#的最適初始pH為7.5，而混合菌劑2#的最適初始pH為8.0。

圖5 pH對不同混合菌劑降解率的影響Fig.5 Effect of pH on degradation rate of mixed bacteria

4 結(jié)論

(1)相比傳統(tǒng)物理、化學(xué)修復(fù)方法，微生物具有成本低、繁殖快、污染物完全氧化等特點(diǎn)，因此使用微生物改良污染的石油土壤，通過改變微生物在油污土壤的外界溫度、濕度、鹽分、氧氣含量和表面活性劑，同時接種高效的降解菌株，強(qiáng)化微生物修復(fù)能力，以此提高菌種在土壤中石油的降解速率。

(2)微生物的種類和菌群對土壤中石油降解具有重要影響，研究表明，混合培養(yǎng)菌的石油降解效果明顯高于單株培養(yǎng)菌，為混合培養(yǎng)菌添加表面活性劑，可提高石油降解效率，顯著改善土壤中石油降解效果。微生物表面活化劑在石油降解過程中具有積極促進(jìn)作用，通過對污染土壤進(jìn)行處理，修復(fù)后土壤中石油污染物的降解率達(dá)88.63%。

(3)每組混合菌種設(shè)置不同的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和pH，不同試驗條件對混合菌種的降解率均有影響。隨著培養(yǎng)時間的延長，對石油的去除率越高，且去除效果越好，采用7 d 為適宜的培養(yǎng)時間，最適宜培養(yǎng)溫度為35 ℃，當(dāng)總接種量為0.5 mL時，混合菌劑最適pH為8.0。試驗結(jié)果顯示，微生物培養(yǎng)環(huán)境達(dá)到以上最適條件，混合菌劑對油污土壤的降解率最大。