熱處理對(duì)14種抗菌藥物抗菌活性的影響

孫德祥，張子涵，陶敏慧，馬倩倩，魯子怡，吳 敏，魏澤能，蔣 軍*，彭開松*

(1.安徽省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，安徽合肥 230601；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水生健康與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036)

內(nèi)服抗菌藥物是當(dāng)前控制水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的主要方式。目前散養(yǎng)戶或小型養(yǎng)殖場(chǎng)主要將抗菌藥物包裹在顆粒飼料表面后進(jìn)行投喂。但是，這種方式制作的藥餌進(jìn)入水中后，抗菌藥物會(huì)很快溶出?？咕幬锏娜艹霾粌H會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物攝入藥餌中的藥物濃度降低、療效減弱甚至無效，而且溶出的藥物會(huì)釋放入水環(huán)境中，造成抗菌藥物的環(huán)境殘留和誘導(dǎo)環(huán)境細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生。水環(huán)境是重要的耐藥基因庫(kù)，這些被誘導(dǎo)的耐藥菌具備經(jīng)食物鏈水平傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)[1]。將抗菌藥物制劑與粉狀的飼料原料混合均勻后制粒，不僅可以減少藥餌被水產(chǎn)動(dòng)物攝入前的抗菌藥物溶出，而且能減少人工拌藥的工作強(qiáng)度，避免出現(xiàn)伴藥不均勻的現(xiàn)象[2]。

隨著水產(chǎn)飼料加工工藝的進(jìn)步，特別是調(diào)質(zhì)工藝和膨化工藝發(fā)展，飼料物料在加工過程中經(jīng)歷的溫度越來越高[3]。一般水產(chǎn)飼料的蒸汽(100 ℃)調(diào)質(zhì)時(shí)間為0.5～2.0 min。傳統(tǒng)硬顆粒飼料從制粒機(jī)出來(物料溫度92 ℃)降至環(huán)境溫度約需10 min。膨化飼料加工中，一般調(diào)質(zhì)腔內(nèi)溫度為73～100 ℃，時(shí)間110 s；擠壓腔溫度一般為85～125 ℃，時(shí)間約需數(shù)秒。一般認(rèn)為，由于制粒和膨化的溫度均超過80 ℃以上，會(huì)對(duì)熱敏感成分產(chǎn)生較大影響[4]。因此，通過模擬試驗(yàn)來初步評(píng)估水產(chǎn)常用抗菌藥物對(duì)熱處理(溫度-時(shí)間)的穩(wěn)定性，對(duì)于選擇藥餌制作方法具有重要指導(dǎo)意義。

氣單胞菌科氣單胞菌屬成員是淡水養(yǎng)殖中最常見的致病菌，也是對(duì)淡水養(yǎng)殖危害最為嚴(yán)重的一類細(xì)菌[5]。筆者以近年來承擔(dān)的農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動(dòng)物病原菌耐藥性普查項(xiàng)目中使用的14種抗菌藥物為測(cè)試藥物，以臨床分離的氣單胞菌為測(cè)試菌，通過測(cè)定藥物存儲(chǔ)液在熱處理前后最小抑菌濃度的變化，來評(píng)價(jià)熱處理對(duì)抗菌藥物的降解率，以期為漁用藥餌制作中能耐受的熱處理強(qiáng)度提供參考。

1 材料與方法

1.1抗菌藥物恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR，批號(hào)20171226，含量98.0%)、鹽酸環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride,CIP,批號(hào)20171123,含量98.0%)、氨芐西林鈉(Ampicillin sodium,AMP,批號(hào)20171212,含量98.6%)、氟苯尼考(Florfenicol,FFC,批號(hào)20170912,含量98.6%)、硫酸新霉素(Neomycin sulfate,NEO,批號(hào)20170920,含量98.5%)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM,批號(hào)20171107,含量98.5%)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD,批號(hào)20170927,含量98.6%)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ,批號(hào)20171220,含量95.5%)、磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine,SMD,批號(hào)20171022,含量96.8%)由華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。硫氰酸紅霉素(Erythromycin thiocyanate,ERT,批號(hào)20171125,含量98.0%)、交沙霉素(Josamycin，JOS,批號(hào)20170923,含量96.5%)、鹽酸多西環(huán)素(Doxycycline hydrochloride，DOX,批號(hào)20171125,含量98.5%)、鹽酸土霉素(Oxytetracycline,OTC,批號(hào)20171224,含量98.8%)、甲砜霉素(Thiamphenicol，TPC,批號(hào)20171125,含量98.8%)均由浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2測(cè)試菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)18J008、凡隆氣單胞菌凡隆生物型(Aeromonasveroniissp.Veronii)18J022、凡隆氣單胞菌溫和生物型(Aeromonasveroniissp.Sobria)18J075、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)18J085、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)18J001均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)水生健康與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3抗菌藥物儲(chǔ)備液的配制按照歐盟標(biāo)準(zhǔn)配制上述14種抗菌藥物的存儲(chǔ)溶液[6]，經(jīng)0.22 μm過濾除菌,分裝到細(xì)胞凍存管中。氨芐西林鈉用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0)溶解?；前粪奏?、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶，先加1/2體積水，然后加入1.0 mol /L NaOH至溶解，補(bǔ)蒸餾水到所需體積。磺胺間甲氧嘧啶、鹽酸土霉素、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星，先加1/2體積水，然后加入2.5 mol /L NaOH至溶解，補(bǔ)蒸餾水到所需體積。硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素，用水溶解。氟苯尼考、甲砜霉素、硫氰酸紅霉素、交沙霉素用95.0%乙醇溶解。

1.4藥物的熱降解率測(cè)定根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?分別在90 ℃水浴鍋中處理10和30 min；在沸水浴(100 ℃)中分別處理10和30 min；在高壓蒸汽滅菌鍋中，分別在115 ℃、20 min或121 ℃、15 min下處理。

藥物存儲(chǔ)液按上述處理后，按照歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法[6]，測(cè)定藥物對(duì)上述細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)。細(xì)菌本身對(duì)某種抗菌藥物的敏感性未發(fā)生變化，藥物對(duì)某種細(xì)菌MIC測(cè)定值的升高倍數(shù)，代表藥物熱降解的倍數(shù)[6]。未經(jīng)過熱處理的某藥物溶液對(duì)某細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC實(shí)際值)是該藥對(duì)該菌的實(shí)際敏感性。MIC實(shí)際值>64 μg/mL的菌藥組合數(shù)據(jù)，由于該菌對(duì)該藥物具有耐藥性，故不能用于后續(xù)熱穩(wěn)定評(píng)價(jià)，視為無效數(shù)據(jù)。經(jīng)熱處理后，部分藥物發(fā)生熱降解，導(dǎo)致MIC測(cè)定值增加。根據(jù)藥物在熱處理前后對(duì)某種細(xì)菌的MIC測(cè)定值的變化，按照以下公式計(jì)算藥物熱降解率(%)：藥物熱降解率=[1-(MIC實(shí)際值/MIC測(cè)定值)]×100%。

鑒于該方法允許一定誤差，若熱降解率為0或50%，則視為熱穩(wěn)定或能耐受該溫度-時(shí)間處理，記為A；若熱降解率為75%或87.5%，則視為比較穩(wěn)定或者基本能耐受此溫度-時(shí)間處理,記為B；若熱降解率大于等于93.8%，則視為不穩(wěn)定或者不能耐受此溫度-時(shí)間處理，記為C。

2 結(jié)果與分析

2.1測(cè)試菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性由表1可知，未經(jīng)熱處理抗菌藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC值中，除氨芐西林鈉對(duì)凡隆氣單胞菌溫和生物型和豚鼠氣單胞菌、磺胺嘧啶對(duì)大腸桿菌、磺胺間甲氧嘧啶對(duì)凡隆氣單胞菌溫和生物型和凡隆氣單胞菌凡隆生物型及豚鼠氣單胞菌、硫酸新霉素對(duì)凡隆氣單胞菌溫和生物型、硫氰酸紅霉素對(duì)豚鼠氣單胞菌的MIC值大于64 μg/mL外，其余均可用于后續(xù)熱處理對(duì)藥物穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。

表1 熱處理對(duì)14種抗菌藥物MIC值的影響

注：0#，未經(jīng)熱處理藥物的MIC實(shí)際值； 1#，90 ℃10 min熱處理后的MIC測(cè)定值； 2#，90 ℃30 min處理后的MIC測(cè)定值； 3#；100 ℃10 min處理后的MIC測(cè)定值。EC,大腸桿菌ATCC 25922;AH,嗜水氣單胞菌18J008;AvV,凡隆氣單胞菌凡隆生物型18J022;AvS,凡隆氣單胞菌溫和生物型18J075;AC,豚鼠氣單胞菌18J085;AS,殺鮭氣單胞菌18J001

Note：0#，actual value of MIC of antibacterial agents without heat treatment；1#，measured value of MIC of antibacterial agents after heat treatment 10 min at 90 ℃；2#，measured value of MIC of antibacterial agents after heat treatment 30 min at 90 ℃； 3#，measured value of MIC of antibacterial agents after heat treatment 10 min at 100 ℃.EC,E.coliATCC 25922;AH,A.hydrophila18J008;AvV,A.veroniissp.Veronii18J022;AvS,,A.veroniissp.Sobria18J075;AC,A.caviae18J085;AS,A.salmonicida18J001

2.2熱處理降解抗菌藥物對(duì)MIC測(cè)定值的影響由表1可知， 90 ℃10 min熱處理對(duì)氨芐西林鈉的MIC測(cè)定值有明顯的影響(MIC測(cè)定值降低4或8倍)，對(duì)磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星/鹽酸環(huán)丙沙星少部分菌升高2倍外；其余均無影響。90 ℃30 min熱處理除對(duì)甲砜霉素、硫氰酸紅霉素、交沙霉素?zé)o影響外，對(duì)其他藥物的MIC測(cè)定值增加了2倍或4倍。100 ℃10 min處理對(duì)該試驗(yàn)中測(cè)試的14種抗菌藥物的MIC測(cè)定值增加了8倍到1 024倍不等。

2.3藥物熱穩(wěn)定性的綜合評(píng)價(jià)由表2可知，90 ℃處理10 min或30 min,試驗(yàn)所用14種抗菌藥物的熱降解率較低，對(duì)其MIC測(cè)定值影響較小。但是，100 ℃10 min處理中，抗菌藥物的熱降解率很高，對(duì)其MIC測(cè)定值的影響很大。該研究中同時(shí)測(cè)定了100 ℃30 min、115 ℃20 min、121 ℃15 min處理對(duì)抗菌藥物MIC測(cè)定值的影響，在這些處理?xiàng)l件下各藥物的抗菌活性均遭到破壞。

表2 微生物法測(cè)定的14種抗菌藥物的熱降解率比較

注：1#，90 ℃10 min； 2#，90 ℃30 min； 3#，100 ℃10 min。EC,大腸桿菌ATCC 25922;AH,嗜水氣單胞菌18J008;AvV,凡隆氣單胞菌凡隆生物型18J022;AvS,凡隆氣單胞菌溫和生物型18J075;AC,豚鼠氣單胞菌18J085;AS,殺鮭氣單胞菌18J001。N代表無效數(shù)據(jù)

Note：1#，90 ℃10 min；2#， 90 ℃30 min；3#；100 ℃10 min；EC,E.coliATCC 25922;AH,A.hydrophila18J008;AvV,A.veroniissp.Veronii18J022;AvS,,A.veroniissp.Sobria18J075;AC,A.caviae18J085;AS,A.salmonicida18J001；N stands for non-effective data

根據(jù)綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，由表3可知，此次評(píng)價(jià)的14種抗菌藥物中熱穩(wěn)定性最差的抗菌藥有氨芐西林鈉(AMP)，熱穩(wěn)定較差的抗菌藥有鹽酸土霉素(OTC)。熱穩(wěn)定性最好的抗菌藥物有硫酸新霉素和硫氰酸紅霉素；其他抗菌藥物的熱穩(wěn)定性中等。

表3微生物法測(cè)定的14種抗菌藥物的熱穩(wěn)定性綜合評(píng)分

Table3Thecomprehensivescoreofthermalstabilityof14kindsofantibacterialagentsdeterminedbymicrobialmethod

抗菌藥物Antibacterialagents熱處理 Heat treatment90 ℃10 min90 ℃30 min100 ℃10 min氨芐西林鈉AMPAA、BC磺胺嘧啶SDAAC磺胺甲噁唑SMZAAC磺胺二甲嘧啶SMDAAC磺胺間甲氧嘧啶SMMAAC硫酸新霉素NEOAAB、C鹽酸土霉素OTCAA、BC鹽酸多西環(huán)素DOXAAC恩諾沙星ENRAAC鹽酸環(huán)丙沙星CIPAAC氟苯尼考FFCAAC甲砜霉素TPCAAC硫氰酸紅霉素ERTAAB、C交沙霉素JOSAAC

3 結(jié)論與討論

該研究中對(duì)14種抗菌藥物的熱耐受能力測(cè)定結(jié)果表明，這些藥物基本能耐受傳統(tǒng)環(huán)模硬顆粒飼料制粒中所需要承受的溫度[3-4]。因此，可以將藥物與粉末狀飼料原料混合均勻后制粒，提高水產(chǎn)動(dòng)物口服給藥的精準(zhǔn)性，減少抗菌藥物浪費(fèi)和抗菌藥物殘留的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[1]。

Hsieh等[7]研究表明，氨芐西林在100 ℃15 min水浴處理后，其MIC值沒有變化；在121 ℃15 min水浴處理后，藥峰面積下降70%，但MIC值僅僅降低2倍。強(qiáng)力霉素水溶液在100 ℃水浴中15 min，對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值沒有變化；但藥物濃度(色譜峰值)降低了30%。但土霉素在100 ℃15 min處理對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別增加32或64倍以上[7],與該研究結(jié)果相似。由此可見，土霉素的熱穩(wěn)定性比強(qiáng)力霉素差。Lolo等[8]研究顯示，恩諾沙星水溶液在100 ℃水浴中能維持穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)3 h。Franje等[9]研究表明氟苯尼考和甲砜霉素在100 ℃熱水浴中加熱2 h，降解率低于20%，且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄菌MIC沒有變化。

總體來看，該研究測(cè)定的14種抗菌藥物原粉的熱穩(wěn)定性要比國(guó)外研究文獻(xiàn)報(bào)道的差一些[7-9]。該差異可能與此次使用是國(guó)產(chǎn)原粉，而不是標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)；也可能與試驗(yàn)中采用的菌株或方法有關(guān)[6-8]。該研究結(jié)果表明，除氨芐西林外，90 ℃ 30 min處理基本不影響其他抗菌藥物的活性。