熱處理對14種抗菌藥物抗菌活性的影響

孫德祥，張子涵，陶敏慧，馬倩倩，魯子怡，吳 敏，魏澤能，蔣 軍*，彭開松*

(1.安徽省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，安徽合肥 230601；2.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院水生健康與公共衛(wèi)生實驗室，安徽合肥 230036)

內(nèi)服抗菌藥物是當前控制水產(chǎn)動物細菌性疾病的主要方式。目前散養(yǎng)戶或小型養(yǎng)殖場主要將抗菌藥物包裹在顆粒飼料表面后進行投喂。但是，這種方式制作的藥餌進入水中后，抗菌藥物會很快溶出?？咕幬锏娜艹霾粌H會導致水產(chǎn)動物攝入藥餌中的藥物濃度降低、療效減弱甚至無效，而且溶出的藥物會釋放入水環(huán)境中，造成抗菌藥物的環(huán)境殘留和誘導環(huán)境細菌的耐藥性產(chǎn)生。水環(huán)境是重要的耐藥基因庫，這些被誘導的耐藥菌具備經(jīng)食物鏈水平傳播給人類的風險[1]。將抗菌藥物制劑與粉狀的飼料原料混合均勻后制粒，不僅可以減少藥餌被水產(chǎn)動物攝入前的抗菌藥物溶出，而且能減少人工拌藥的工作強度，避免出現(xiàn)伴藥不均勻的現(xiàn)象[2]。

隨著水產(chǎn)飼料加工工藝的進步，特別是調(diào)質(zhì)工藝和膨化工藝發(fā)展，飼料物料在加工過程中經(jīng)歷的溫度越來越高[3]。一般水產(chǎn)飼料的蒸汽(100 ℃)調(diào)質(zhì)時間為0.5～2.0 min。傳統(tǒng)硬顆粒飼料從制粒機出來(物料溫度92 ℃)降至環(huán)境溫度約需10 min。膨化飼料加工中，一般調(diào)質(zhì)腔內(nèi)溫度為73～100 ℃，時間110 s；擠壓腔溫度一般為85～125 ℃，時間約需數(shù)秒。一般認為，由于制粒和膨化的溫度均超過80 ℃以上，會對熱敏感成分產(chǎn)生較大影響[4]。因此，通過模擬試驗來初步評估水產(chǎn)常用抗菌藥物對熱處理(溫度-時間)的穩(wěn)定性，對于選擇藥餌制作方法具有重要指導意義。

氣單胞菌科氣單胞菌屬成員是淡水養(yǎng)殖中最常見的致病菌，也是對淡水養(yǎng)殖危害最為嚴重的一類細菌[5]。筆者以近年來承擔的農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物病原菌耐藥性普查項目中使用的14種抗菌藥物為測試藥物，以臨床分離的氣單胞菌為測試菌，通過測定藥物存儲液在熱處理前后最小抑菌濃度的變化，來評價熱處理對抗菌藥物的降解率，以期為漁用藥餌制作中能耐受的熱處理強度提供參考。

1 材料與方法

1.1抗菌藥物恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR，批號20171226，含量98.0%)、鹽酸環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride,CIP,批號20171123,含量98.0%)、氨芐西林鈉(Ampicillin sodium,AMP,批號20171212,含量98.6%)、氟苯尼考(Florfenicol,FFC,批號20170912,含量98.6%)、硫酸新霉素(Neomycin sulfate,NEO,批號20170920,含量98.5%)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM,批號20171107,含量98.5%)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD,批號20170927,含量98.6%)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ,批號20171220,含量95.5%)、磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine,SMD,批號20171022,含量96.8%)由華北制藥集團有限責任公司生產(chǎn)。硫氰酸紅霉素(Erythromycin thiocyanate,ERT,批號20171125,含量98.0%)、交沙霉素(Josamycin，JOS,批號20170923,含量96.5%)、鹽酸多西環(huán)素(Doxycycline hydrochloride，DOX,批號20171125,含量98.5%)、鹽酸土霉素(Oxytetracycline,OTC,批號20171224,含量98.8%)、甲砜霉素(Thiamphenicol，TPC,批號20171125,含量98.8%)均由浙江國邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2測試菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)18J008、凡隆氣單胞菌凡隆生物型(Aeromonasveroniissp.Veronii)18J022、凡隆氣單胞菌溫和生物型(Aeromonasveroniissp.Sobria)18J075、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)18J085、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)18J001均由安徽農(nóng)業(yè)大學水生健康與公共衛(wèi)生實驗室保存。

1.3抗菌藥物儲備液的配制按照歐盟標準配制上述14種抗菌藥物的存儲溶液[6]，經(jīng)0.22 μm過濾除菌,分裝到細胞凍存管中。氨芐西林鈉用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0)溶解?；前粪奏?、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶，先加1/2體積水，然后加入1.0 mol /L NaOH至溶解，補蒸餾水到所需體積?；前烽g甲氧嘧啶、鹽酸土霉素、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星，先加1/2體積水，然后加入2.5 mol /L NaOH至溶解，補蒸餾水到所需體積。硫酸新霉素、強力霉素，用水溶解。氟苯尼考、甲砜霉素、硫氰酸紅霉素、交沙霉素用95.0%乙醇溶解。

1.4藥物的熱降解率測定根據(jù)試驗目的,分別在90 ℃水浴鍋中處理10和30 min；在沸水浴(100 ℃)中分別處理10和30 min；在高壓蒸汽滅菌鍋中，分別在115 ℃、20 min或121 ℃、15 min下處理。

藥物存儲液按上述處理后，按照歐盟標準方法[6]，測定藥物對上述細菌的最小抑菌濃度(MIC)。細菌本身對某種抗菌藥物的敏感性未發(fā)生變化，藥物對某種細菌MIC測定值的升高倍數(shù)，代表藥物熱降解的倍數(shù)[6]。未經(jīng)過熱處理的某藥物溶液對某細菌的最小抑菌濃度(MIC實際值)是該藥對該菌的實際敏感性。MIC實際值>64 μg/mL的菌藥組合數(shù)據(jù)，由于該菌對該藥物具有耐藥性，故不能用于后續(xù)熱穩(wěn)定評價，視為無效數(shù)據(jù)。經(jīng)熱處理后，部分藥物發(fā)生熱降解，導致MIC測定值增加。根據(jù)藥物在熱處理前后對某種細菌的MIC測定值的變化，按照以下公式計算藥物熱降解率(%)：藥物熱降解率=[1-(MIC實際值/MIC測定值)]×100%。

鑒于該方法允許一定誤差，若熱降解率為0或50%，則視為熱穩(wěn)定或能耐受該溫度-時間處理，記為A；若熱降解率為75%或87.5%，則視為比較穩(wěn)定或者基本能耐受此溫度-時間處理,記為B；若熱降解率大于等于93.8%，則視為不穩(wěn)定或者不能耐受此溫度-時間處理，記為C。

2 結(jié)果與分析

2.1測試菌株對抗菌藥物的敏感性由表1可知，未經(jīng)熱處理抗菌藥物對測試菌的MIC值中，除氨芐西林鈉對凡隆氣單胞菌溫和生物型和豚鼠氣單胞菌、磺胺嘧啶對大腸桿菌、磺胺間甲氧嘧啶對凡隆氣單胞菌溫和生物型和凡隆氣單胞菌凡隆生物型及豚鼠氣單胞菌、硫酸新霉素對凡隆氣單胞菌溫和生物型、硫氰酸紅霉素對豚鼠氣單胞菌的MIC值大于64 μg/mL外，其余均可用于后續(xù)熱處理對藥物穩(wěn)定性的評價。

表1 熱處理對14種抗菌藥物MIC值的影響

注：0#，未經(jīng)熱處理藥物的MIC實際值； 1#，90 ℃10 min熱處理后的MIC測定值； 2#，90 ℃30 min處理后的MIC測定值； 3#；100 ℃10 min處理后的MIC測定值。EC,大腸桿菌ATCC 25922;AH,嗜水氣單胞菌18J008;AvV,凡隆氣單胞菌凡隆生物型18J022;AvS,凡隆氣單胞菌溫和生物型18J075;AC,豚鼠氣單胞菌18J085;AS,殺鮭氣單胞菌18J001

Note：0#，actual value of MIC of antibacterial agents without heat treatment；1#，measured value of MIC of antibacterial agents after heat treatment 10 min at 90 ℃；2#，measured value of MIC of antibacterial agents after heat treatment 30 min at 90 ℃； 3#，measured value of MIC of antibacterial agents after heat treatment 10 min at 100 ℃.EC,E.coliATCC 25922;AH,A.hydrophila18J008;AvV,A.veroniissp.Veronii18J022;AvS,,A.veroniissp.Sobria18J075;AC,A.caviae18J085;AS,A.salmonicida18J001

2.2熱處理降解抗菌藥物對MIC測定值的影響由表1可知， 90 ℃10 min熱處理對氨芐西林鈉的MIC測定值有明顯的影響(MIC測定值降低4或8倍)，對磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星/鹽酸環(huán)丙沙星少部分菌升高2倍外；其余均無影響。90 ℃30 min熱處理除對甲砜霉素、硫氰酸紅霉素、交沙霉素無影響外，對其他藥物的MIC測定值增加了2倍或4倍。100 ℃10 min處理對該試驗中測試的14種抗菌藥物的MIC測定值增加了8倍到1 024倍不等。

2.3藥物熱穩(wěn)定性的綜合評價由表2可知，90 ℃處理10 min或30 min,試驗所用14種抗菌藥物的熱降解率較低，對其MIC測定值影響較小。但是，100 ℃10 min處理中，抗菌藥物的熱降解率很高，對其MIC測定值的影響很大。該研究中同時測定了100 ℃30 min、115 ℃20 min、121 ℃15 min處理對抗菌藥物MIC測定值的影響，在這些處理條件下各藥物的抗菌活性均遭到破壞。

表2 微生物法測定的14種抗菌藥物的熱降解率比較

注：1#，90 ℃10 min； 2#，90 ℃30 min； 3#，100 ℃10 min。EC,大腸桿菌ATCC 25922;AH,嗜水氣單胞菌18J008;AvV,凡隆氣單胞菌凡隆生物型18J022;AvS,凡隆氣單胞菌溫和生物型18J075;AC,豚鼠氣單胞菌18J085;AS,殺鮭氣單胞菌18J001。N代表無效數(shù)據(jù)

Note：1#，90 ℃10 min；2#， 90 ℃30 min；3#；100 ℃10 min；EC,E.coliATCC 25922;AH,A.hydrophila18J008;AvV,A.veroniissp.Veronii18J022;AvS,,A.veroniissp.Sobria18J075;AC,A.caviae18J085;AS,A.salmonicida18J001；N stands for non-effective data

根據(jù)綜合評價標準，由表3可知，此次評價的14種抗菌藥物中熱穩(wěn)定性最差的抗菌藥有氨芐西林鈉(AMP)，熱穩(wěn)定較差的抗菌藥有鹽酸土霉素(OTC)。熱穩(wěn)定性最好的抗菌藥物有硫酸新霉素和硫氰酸紅霉素；其他抗菌藥物的熱穩(wěn)定性中等。

表3微生物法測定的14種抗菌藥物的熱穩(wěn)定性綜合評分

Table3Thecomprehensivescoreofthermalstabilityof14kindsofantibacterialagentsdeterminedbymicrobialmethod

抗菌藥物Antibacterialagents熱處理 Heat treatment90 ℃10 min90 ℃30 min100 ℃10 min氨芐西林鈉AMPAA、BC磺胺嘧啶SDAAC磺胺甲噁唑SMZAAC磺胺二甲嘧啶SMDAAC磺胺間甲氧嘧啶SMMAAC硫酸新霉素NEOAAB、C鹽酸土霉素OTCAA、BC鹽酸多西環(huán)素DOXAAC恩諾沙星ENRAAC鹽酸環(huán)丙沙星CIPAAC氟苯尼考FFCAAC甲砜霉素TPCAAC硫氰酸紅霉素ERTAAB、C交沙霉素JOSAAC

3 結(jié)論與討論

該研究中對14種抗菌藥物的熱耐受能力測定結(jié)果表明，這些藥物基本能耐受傳統(tǒng)環(huán)模硬顆粒飼料制粒中所需要承受的溫度[3-4]。因此，可以將藥物與粉末狀飼料原料混合均勻后制粒，提高水產(chǎn)動物口服給藥的精準性，減少抗菌藥物浪費和抗菌藥物殘留的生態(tài)風險[1]。

Hsieh等[7]研究表明，氨芐西林在100 ℃15 min水浴處理后，其MIC值沒有變化；在121 ℃15 min水浴處理后，藥峰面積下降70%，但MIC值僅僅降低2倍。強力霉素水溶液在100 ℃水浴中15 min，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值沒有變化；但藥物濃度(色譜峰值)降低了30%。但土霉素在100 ℃15 min處理對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別增加32或64倍以上[7],與該研究結(jié)果相似。由此可見，土霉素的熱穩(wěn)定性比強力霉素差。Lolo等[8]研究顯示，恩諾沙星水溶液在100 ℃水浴中能維持穩(wěn)定長達3 h。Franje等[9]研究表明氟苯尼考和甲砜霉素在100 ℃熱水浴中加熱2 h，降解率低于20%，且對大腸桿菌和金黃色葡萄菌MIC沒有變化。

總體來看，該研究測定的14種抗菌藥物原粉的熱穩(wěn)定性要比國外研究文獻報道的差一些[7-9]。該差異可能與此次使用是國產(chǎn)原粉，而不是標準品有關；也可能與試驗中采用的菌株或方法有關[6-8]。該研究結(jié)果表明，除氨芐西林外，90 ℃ 30 min處理基本不影響其他抗菌藥物的活性。