一種從杜仲翅果中快速提取杜仲橡膠的方法

楊 洪，候嵐菲，林奕冬，陳露露，2，代龍軍，王笛菲，向 賢，2，鄧 治，杜紅巖，李德軍*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室，海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海南儋州571737；2.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南?？?70228；3.國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南鄭州 450003)

杜仲(Eucommiaulmoides)為杜仲科植物，是我國特有的名貴藥材和木本油料植物。杜仲渾身都是寶，皮、花、果、葉等具有很高的食用和藥用價值。杜仲富含綠原酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖甙、氨基酸、環(huán)烯醚萜、黃酮及微量元素等活性成分，具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗菌消炎、安胎、利尿、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。目前，杜仲籽油和杜仲雄花作為新資源食品原料獲得國家批準(zhǔn)，杜仲葉也通過藥食同源專家評審。此外，以杜仲葉為原料的功能飼料能增加畜禽體內(nèi)膠原蛋白含量，減少中性脂肪和膽固醇含量，提高畜禽免疫力[4-5]。

杜仲是僅次于巴西橡膠樹的優(yōu)質(zhì)膠源樹種。杜仲適生區(qū)域分布在全國 27 個省(區(qū)、市)，而我國巴西橡膠樹的種植區(qū)域主要分布在海南、云南、廣東等地，在地理分布上與巴西橡膠樹相比具有明顯優(yōu)勢。杜仲根、莖、葉、果皮等部位均含有杜仲橡膠，其中果皮的含膠量最高達(dá)15%～18%[6]。杜仲橡膠(E.ulmoidesrubber，EUR)與天然橡膠(產(chǎn)自巴西橡膠樹)均為聚異戊二烯，但是天然橡膠為順式-聚異戊二烯，常溫下為柔軟的彈性體，而杜仲橡膠為反式-聚異戊二烯，常溫下易結(jié)晶。將杜仲橡膠和天然橡膠按一定比例共混能夠提升復(fù)合材料的理化特性，可以滿足仿生醫(yī)學(xué)、工程機(jī)械等高端領(lǐng)域的應(yīng)用需求[7]。

杜仲橡膠以絲狀固態(tài)存在于含膠細(xì)胞中，因此不能像天然橡膠那樣通過割膠收集而需要通過多步提取工藝獲取。杜仲橡膠的提取可以分為三大步驟：細(xì)胞壁破除、杜仲橡膠提取、杜仲橡膠的分離純化。目前，杜仲橡膠的提取主要有化學(xué)溶劑法、微生物發(fā)酵法和生物酶解法[8-13]。然而，這些提取方法都存在溶劑消耗多、成本高、步驟繁瑣、耗時長等問題。該研究以杜仲翅果為原料，通過堿液水解獲得杜仲粗膠，再以4種有機(jī)溶劑為萃取溶劑常溫下浸提，可在實驗室小量快速提取杜仲橡膠，以滿足研究用膠需求。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1原料。杜仲翅果由中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心提供。

1.1.2儀器。電子天平BSA224S(德國賽多利斯)；臺式離心機(jī)(Thermo Scientific)；ZNCL-GS油浴鍋(河南愛博特科技發(fā)展有限公司)；索氏提取器(規(guī)格為 500 mL)；其他常用玻璃儀器均為天津市天科玻璃儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.1.3試劑。石油醚(沸程60～90 ℃)、苯、甲醇、四氯化碳、環(huán)己烷、溴水、氫氧化鈉等為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純試劑。

1.2試驗方法

1.2.1堿浸法提取杜仲粗膠[14]。取100 g杜仲翅果，碾壓、脫殼去除果仁后用5% 氫氧化鈉水溶液90 ℃浸提3 h，充分分解纖維素、木質(zhì)素等非膠物質(zhì)。所得的溶液過濾后，用去離子水將濾渣沖洗至中性后烘干即為杜仲粗膠。

1.2.2杜仲精膠快速提取。分別以石油醚、環(huán)己烷、苯、四氯化碳4種有機(jī)溶劑為萃取溶劑，采用室溫浸提法從杜仲粗膠中快速提取杜仲精膠。稱取約2 g杜仲粗膠，在潔凈三角瓶中用40 mL有機(jī)溶劑萃取1～3次，5 000 r/min離心5 min分離有機(jī)相，得到含膠溶液；向含膠溶液中加入40%(V/V)體積的甲醇析膠，得到的杜仲橡膠用不銹鋼篩過濾，烘干后稱重。

1.2.3索式抽提杜仲橡膠[14-15]。稱取約2 g杜仲粗膠，分別加入石油醚和環(huán)己烷回流抽提，85 ℃(石油醚)和125 ℃(環(huán)己烷)抽提36 h，所得含膠溶液用40%(V/V)體積的甲醇析出杜仲膠，沉淀用不銹鋼篩過濾，干燥后得到杜仲精膠。

1.2.4杜仲橡膠提取得率計算。杜仲橡膠得率計算方法如下：

X=M1/M0×100%

(1)

式中，X為杜仲橡膠提取得率(%)；M1為提取精制后的杜仲橡膠質(zhì)量(g)；M0為杜仲粗膠的質(zhì)量(g)。

1.2.5杜仲橡膠的鑒別。杜仲橡膠采用韋氏法[16]進(jìn)行鑒別。精確稱取約0.100 0 g待測杜仲膠塊，剪碎后放入帶蓋坩堝中，向坩堝中滴加數(shù)滴四氯化碳后靜置使其充分溶脹，滴加4～6滴溴水，再用2 g苯酚覆蓋試樣。然后將坩堝置于沸水浴加熱5 min，以加快反應(yīng)速度，并使四氯化碳完全揮發(fā)。若產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)紫色，則表明該試樣是杜仲橡膠。應(yīng)用該方法鑒定杜仲橡膠，反應(yīng)現(xiàn)象明顯，反應(yīng)迅速，靈敏度高。

1.2.6杜仲橡膠純度測定。杜仲橡膠純度采用天然生膠雜質(zhì)含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 8086—2008)進(jìn)行測定。將試樣剪成寬 5 mm 的細(xì)條狀，放入干燥潔凈的250 mL三角瓶中，加入含 150 mL橡膠溶劑(0.25% 2-硫醇基苯并噻唑)，125～130 ℃油浴加熱使之充分溶解。然后趁熱用已稱重的孔徑為 45 μm 的潔凈不銹鋼篩過濾。用預(yù)熱的橡膠溶劑反復(fù)沖洗不銹鋼篩3～5次，以保證無膠殘留在鋼篩上。含有雜質(zhì)的鋼篩在石油醚中浸泡15～20 min后取出瀝干，于烘箱中烘至恒重。杜仲膠純度計算方法為：

A=1-(W2-W1)/W0×100%

(2)

式中，A為純度(%)，W0為測試樣品重量(g)，W1為不銹鋼篩重量(g)，W2為雜質(zhì)和不銹鋼篩重量(g)。

1.2.7提取效率計算。索式抽提法是實驗室提取杜仲橡膠的經(jīng)典方法，因此以索式抽提法為參照計算不同萃取溶劑常溫快速提取杜仲橡膠的提取效率。提取效率計算方法如下：

η=(A1×X1/A2×X2)×100%

(3)

式中，η為提取效率，A1和X1分別為某種萃取溶劑三次提取所得杜仲橡膠的純度和得率的平均值，A2和X2分別為索式抽提法使用該種溶劑3次提取所得杜仲橡膠的純度和提取得率的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1杜仲粗膠的制備將杜仲翅果進(jìn)行碾壓、脫殼，除去不含膠的果仁。此時，杜仲翅果被碾壓成片狀但杜仲膠沒有暴露(圖1a)。為使杜仲翅果中的杜仲膠充分暴露，采用堿浸法提取杜仲粗膠。經(jīng)5%氫氧化鈉溶液90 ℃浸提3 h，所得溶液過濾后將濾渣用去離子水沖洗至中性，55 ℃烘干得到白色絮狀的杜仲粗膠(圖1b)。

注：a.杜仲翅果；b.杜仲粗膠Note：a.E.ulmoides key-fruits；b.Crude EUR圖1 杜仲翅果和杜仲粗膠Fig.1 E.ulmoides key-fruits and crude EUR

2.2杜仲精膠快速提取分別以苯、環(huán)己烷、石油醚、四氯化碳為萃取溶劑，采用室溫浸提法從杜仲粗膠中萃取杜仲膠，通過短時低速離心可將含膠有機(jī)相和雜質(zhì)分離，得到杜仲精膠。利用韋氏鑒別法，4種萃取溶劑提取到的杜仲橡膠反應(yīng)后均呈藍(lán)色，說明4種有機(jī)溶劑都能從杜仲橡膠粗膠樣品中萃取杜仲橡膠，均可作為杜仲粗膠室溫浸提法的萃取溶劑。以苯和石油醚為萃取溶劑提取的杜仲橡膠晾干后呈薄片狀，略帶有灰色雜質(zhì)(圖2a和2b)。環(huán)己烷為萃取溶劑提取到的杜仲橡膠呈薄膜狀，帶有黃色色素污染(圖2c)。四氯化碳為萃取溶劑提取到的杜仲橡膠呈較深的棕色(圖2d)。經(jīng)得率和純度測定，4種萃取溶劑所得的杜仲橡膠得率和純度從高到低依次為石油醚、環(huán)己烷、苯和四氯化碳(圖3和表1)。

注：a.苯提取到的杜仲精膠；b.石油醚提取到的杜仲精膠；c.環(huán)己烷提取到的杜仲精膠；d.四氯化碳提取到的杜仲橡膠Note：a.High-quality EUR extracted with benzene；b.High-quality EUR extracted with petroleum ether；c.High-quality EUR extracted with cyclohexane；d.EUR extracted with carbon tetrachloride圖2 4種不同萃取溶劑提取到的杜仲精膠Fig.2 High-quality EUR extracted with four different organic solvents

圖3 4種有機(jī)萃取溶劑提取的杜仲橡膠得率和純度Fig.3 The purity and yield of the EUR extracted with four different organic solvents

萃取溶劑Organic solvents樣品Sampleg膠重Weights of EURg得率Yield%純度Purity%苯Benzene2.009 70.552 827.5190.67環(huán)己烷Cyclohexane2.017 20.570 428.2891.59石油醚Petroleum ether2.024 20.642 331.7392.69四氯化碳Carbon tetra-chloride2.013 50.526 226.1383.83

注：所列數(shù)據(jù)為3次測定的平均值

Note：The values listed represent the average of three replicates

2.3索式抽提法提取杜仲精膠為比較4種不同有機(jī)萃取溶劑從杜仲粗膠中萃取杜仲橡膠精膠的效率，選擇得率和所得杜仲橡膠純度較高的石油醚和環(huán)己烷為回流溶劑進(jìn)行索式回流抽提。稱取2 g左右杜仲粗膠，加入石油醚或環(huán)己烷分別進(jìn)行回流抽提。分別在85 ℃(石油醚)和125 ℃(環(huán)己烷)下回流抽提36 h。以石油醚為回流溶劑抽提得到的杜仲橡膠呈白色(圖4a)，而以環(huán)己烷為回流溶劑抽提得到的杜仲橡膠略帶黃色(圖4b)。從表2和圖5可以看出，用石油醚回流抽提得率和純度均高于環(huán)己烷抽提。因此，該研究提取效率的計算以石油醚為回流溶劑的索式抽提法作為參照。

注：a.石油醚提取杜仲精膠；b.環(huán)己烷提取杜仲精膠Note：a.EUR extracted with petroleum ether；b.EUR extracted with cyclohexane圖4 索式抽提法提取到的杜仲精膠Fig.4 The EUR extracted with Soxhlet apparatus

2.4抽提效率對比從圖6可以看出，室溫浸提法4種不同萃取溶劑中石油醚浸提效率最高，是石油醚回流索式抽提的62.46%；其次是環(huán)己烷和苯，效率分別為55.14%和52.97%；四氯化碳浸提效率最低，僅為47.08%。

表2不同回流溶劑對索式抽提法提取杜仲精膠的影響

Table2TheeffectofdifferentsolventsonextractionofEURwithSoxhletappratus

回流溶劑Refluxing solvent樣品重Weight of sampleg膠重Weight of EURg得率Yield%膠純度Purity%石油醚Petroleum ether2.0280.99048.8196.48環(huán)己烷Cyclohexane2.0460.75436.8695.07

注：所列數(shù)據(jù)為3次測定的平均值

Note：The values listed represent the average of three replicates

圖5 不同回流溶劑索式抽提的得率和膠純度Fig.5 The purity and yield of the EUR extracted by different solvents with Soxhlet appratus

圖6 4種萃取溶劑的杜仲橡膠提取效率Fig.6 The EUR extraction efficiency of the four extraction solvents

3 結(jié)論

以杜仲果為原料，用堿浸法使纖維素、木質(zhì)素等非膠物質(zhì)分解，再經(jīng)過濾、沖洗、烘干得到杜仲粗膠。以4種有機(jī)溶劑作為萃取溶劑，采用室溫浸提法對杜仲粗膠進(jìn)行精提取，結(jié)果表明4種有機(jī)溶劑均能從杜仲粗膠中萃取到杜仲精膠。對得率和提取到的杜仲精膠純度分析表明，以石油醚為萃取溶劑提取效果最佳，其次是環(huán)己烷。以石油醚回流索式抽提法為參照，4種有機(jī)溶劑快速提取杜仲精膠的效率從高到低依次為石油醚、環(huán)己烷、苯和四氯化碳。綜合考慮得率、純度和提取效率3個因素，石油醚為杜仲精膠室溫浸提的最佳萃取溶劑。該方法簡單易行，無需復(fù)雜的玻璃儀器。溶劑消耗少，且可以回收循環(huán)使用，具有提取周期短、對環(huán)境污染小的優(yōu)點，可以用于實驗室從杜仲橡膠翅果中快速提取杜仲精膠。