基于三唑磷殘留限量值的多檢測線免疫試紙條的制備與應(yīng)用

龔航 劉貝貝 李盼 何丹 郭逸蓉 王利民 華修德 王鳴華 劉鳳權(quán) 徐振林 張存政 王麗

摘 要 建立了基于三唑磷殘留限量值（MRL）的免疫層析檢測方法，可裸眼觀察判斷谷物、蔬菜和水果中的三唑磷農(nóng)藥殘留水平。以粒徑20 nm的膠體金標(biāo)記三唑磷單克隆抗體于金標(biāo)墊上，包被不同濃度的三唑磷包被原（檢測線T1、T2、T3線）、羊抗小鼠IgG抗體（質(zhì)控線C線）于硝酸纖維素（NC膜）上，與吸水墊及PVC底板組合成層析試紙條。以大米、甘藍(lán)和蘋果為對象，優(yōu)化了樣品前處理方法、提取試劑等條件。結(jié)果表明，基于1/10 三唑磷MRL值的試紙條（I）對三唑磷的裸眼觀察檢測靈敏度可達(dá)0.005、 0.01和0.02 μg/mL，優(yōu)化調(diào)整后獲得試紙條Ⅱ靈敏度設(shè)定為國標(biāo)GB2763中的三唑磷MRL值依次為0.05、 0.1和0.2 μg/mL，并與3條檢測線一一對應(yīng)。 結(jié)合前處理方法優(yōu)化結(jié)果，樣品經(jīng)乙腈提取后， 用PBS稀釋10倍或者等體積溶劑置換后檢測，此兩種試紙條在8～12 min內(nèi)均可準(zhǔn)確判定農(nóng)產(chǎn)品中三唑磷的殘留是否超過MRL值，同時多區(qū)間定量范圍的設(shè)定亦可較為準(zhǔn)確地定量其殘留值，結(jié)果與GC方法一致。本研究采用基于MRL值的3條檢測線，對檢測結(jié)果的判定更為直接、準(zhǔn)確，無需換算，為基于MRL農(nóng)產(chǎn)品安全性的快速判斷提供了更為直觀、簡單、準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞 三唑磷； 免疫層析試紙條； 殘留限量值； 快速檢測

1 引 言

三唑磷（Triazophos O，O-二乙基-O-（1-苯基1，2，4三唑-3-基）硫代磷酸酯）是一種廣譜性殺蟲劑[1]，對魚類、蜜蜂、家蠶具有高毒性[2]，對哺乳動物有中等毒性，可抑制乙酰膽堿酯酶活性，從而影響中樞神經(jīng)功能[3，4]。三唑磷作為高效替代農(nóng)藥已在全國推廣應(yīng)用多年，在甲胺磷、對硫磷等高毒有機(jī)磷殺蟲劑被限制或禁止使用之后，三唑磷以其低毒、高效和廣譜的特點(diǎn)在水稻等作物上的使用量迅速增加。但三唑磷的半衰期較長，在環(huán)境中易殘留，可通過遷移、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)化進(jìn)入食物鏈，對環(huán)境、生物以及人類健康產(chǎn)生危害[5]。各國均對三唑磷的殘留進(jìn)行了限定[6，7]。國標(biāo)GB 2763-2016對谷物、油料和蔬菜、水果中三唑磷的最大殘留限量分別為0.05、0.1和0.2 mg/kg[8]；農(nóng)業(yè)部公告第2032號規(guī)定，從2016年12月31日起，禁止在蔬菜上使用三唑磷。因此，建立三唑磷殘留快速檢測技術(shù)，對于保障食品安全和人類健康、減少環(huán)境污染具有重要意義。

三唑磷殘留的常規(guī)檢測方法主要包括色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和其它生物分析方法。色譜法主要包括氣相色譜法（GC）[9～13]，高效液相色譜法（HPLC）[14，15]和高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）[16～18]。儀器分析方法準(zhǔn)確性高、專一性強(qiáng)，但樣品前處理過程復(fù)雜，耗時長，需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，不利于對大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測和監(jiān)測?？焖贆z測方法包括表面增強(qiáng)拉曼光譜法[19，20]、酶聯(lián)免疫試劑盒[5，21，22]、壓電免疫傳感器[23]和膠體金免疫層析試紙條等。其中膠體金免疫層析試紙條操作方便，檢測時間短，不需要復(fù)雜儀器判定，定性準(zhǔn)確，裸眼即可觀察結(jié)果，是目前應(yīng)用最廣的快速檢測方法。Gui等[24]用膠體金免疫層析試紙條檢測加標(biāo)土壤和水中的三唑磷農(nóng)藥殘留，LOD達(dá)到5 ng/mL。Guo等[25]建立了兩種同時檢測克百威和三唑磷的膠體金免疫層析試紙條，對三唑磷的最低檢測濃度分別達(dá)到了8和4 μg/L。文獻(xiàn)[26，27]分別建立了一種多條檢測線、裸眼半定量檢測黃曲霉毒素的膠體金免疫層析試紙條，使檢測結(jié)果能提供更多參考信息。但基于三唑磷MRL值的農(nóng)產(chǎn)品安全性檢測、裸眼數(shù)字化的膠體金免疫層析試紙條的研究未見報道，本研究通過設(shè)定檢測線閾值，建立了基于三唑磷殘留限量值（MRL）的免疫層析檢測方，裸眼觀察即可確定三唑磷農(nóng)藥殘留量范圍，并與儀器方法進(jìn)行了比對，以大米、甘藍(lán)和蘋果為模型樣本進(jìn)行了方法驗(yàn)證。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

XYZ3050TM膠體金噴膜機(jī)（Bio-Dot公司）；ZQ2000微電腦自動斬切機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；Lambda25UV/VIS spectrometer 雙光束紫外可見分光光度計（美國PerkinElmer公司）；Multiscan ascent 酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；6890N氣相色譜儀（美國Agilent公司）；硝酸纖維素膜（NC膜）、金標(biāo)結(jié)合墊、吸水墊（美國Millipore公司）；聚氯乙烯（PVC）底板、樣品墊（上海金標(biāo)科技生物有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超純水凈化儀（Labconco公司）。

2.2 膠體金制備與標(biāo)記

2.2.1 膠體金制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[29]：在200 mL超純水中加入2% HAuCl4溶液1 mL，加熱至沸；快速加入1%檸檬酸三鈉溶液4.8 mL，繼續(xù)加熱4 min；得到的酒紅色液體即為制備的膠體金溶液。室溫避光冷卻后，用超純水定容至200 mL，4℃避光保存。

2.2.2 pH值優(yōu)化 向10個已加入1 mL膠體金的離心管中依次分別加入0、1、2、3、4、5、6、7、8和9 μL的K2CO3（0.1 mol/L）溶液調(diào)節(jié)pH值，混勻后，分別加入20 μL三唑磷單克隆抗體溶液（1 mg/mL），混勻后靜置2 h觀察，將未出現(xiàn)沉淀的溶液取上清液，在400 ～ 600 nm處進(jìn)行吸光度測定，吸光度最大的膠體金溶液所對應(yīng)的K2CO3用量，即為最佳pH值標(biāo)記條件。

2.3 膠體金免疫探針的制備

2.3.1 抗體最佳標(biāo)記量的確定 取11個2 mL離心管，分別加入調(diào)至最佳pH值的膠體金溶液，再依次加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 μL三唑磷單克隆抗體溶液（1 mg/mL），室溫靜置5 min，分別加入10% （m/V）NaCl溶液100 μL，5 min后觀察各管溶液顏色變化，判斷抗體最適標(biāo)記量。

2.3.2 膠體金標(biāo)記抗體 取5 mL調(diào)至最佳pH值的膠體金溶液，攪拌下緩慢加入最適量的抗體（1 mg/mL），攪拌30 min；加入10% BSA溶液，使BSA終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30 min后，1500 r/min離心15 min，棄去沉淀；上清液以12000 r/min離心35 min后，棄上清液，加入洗滌保存液（0.01%硼酸，0.2% PEG20000，0.02% NaN3）重懸沉淀至原體積；再以12000 r/min 離心35 min后，棄去上清液，加入5 mL洗滌保存液重懸沉淀，即得金標(biāo)三唑磷單克隆抗體復(fù)合物，于4℃避光保存。

2.4 免疫試紙條的準(zhǔn)備

2.4.1 試紙條的組裝 將NC膜貼在PVC底板的中間，在NC膜的一端依次貼上金標(biāo)抗體結(jié)合墊和樣品墊。將吸水墊貼在NC膜的另一端，樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、NC膜、吸水墊依次交疊1 mm。將3種不同濃度的三唑磷包被原與羊抗小鼠IgG分別噴涂在NC膜上作為檢測線（T1、T2、T3線）和質(zhì)控線（C線），在金標(biāo)結(jié)合墊上噴涂上金標(biāo)三唑磷單克隆抗體，37℃干燥2 h。組裝的試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.4.2 基于MRL值的試紙條檢測及結(jié)果判定 采用ELISA常用的棋盤滴定法優(yōu)化3條檢測線噴涂三唑磷包被原的量，以及固定金標(biāo)抗體的量，以不同的三唑磷MRL值為檢測限，當(dāng)相對應(yīng)檢測線顏色消失時，可以確定檢測三唑磷濃度范圍，并可直觀確定殘留量是否超標(biāo)。結(jié)果判定示意圖如圖2所示。

（1）當(dāng)待檢樣品不含或者所含三唑磷濃度小于0.05 μg/mL時，溶液因毛細(xì)作用向上遷移，溶解金標(biāo)墊上膠體金標(biāo)記的三唑磷單克隆抗體，并與之形成復(fù)合物，多余的三唑磷單克隆抗體繼續(xù)向上遷移，到達(dá)檢測線時，與檢測線上的三唑磷包被原結(jié)合形成沉積，使T1線顯色；過量的金標(biāo)三唑磷抗體及與三唑磷結(jié)合形成的復(fù)合物繼續(xù)向上遷移，依次與T2線和T3線包被的三唑磷包被原結(jié)合；同時過量的金標(biāo)三唑磷抗體及其與三唑磷結(jié)合形成的復(fù)合物繼續(xù)向上遷移，與質(zhì)控線（C線）上的羊抗鼠二抗結(jié)合，形成肉眼可見的紅色。此時3條檢測線與質(zhì)控線均顯色，結(jié)果判斷為陰性 （圖2A）。

（2）當(dāng)待檢樣品中三唑磷濃度在0.05～0.10 μg/mL范圍時， 其作用原理同（1），但由于樣品液中的三唑磷消耗掉了一部分金標(biāo)抗體形成復(fù)合物，而金標(biāo)三唑磷抗體優(yōu)先與T1、T2線包被的三唑磷包被原結(jié)合，形成肉眼可見的紅色條帶，使得到達(dá)T3線時金標(biāo)三唑磷抗體濃度不足以與T3包被的三唑磷包被原反應(yīng)，此時T3線完全消失 （圖2B） 。

（3）當(dāng)待檢樣品中三唑磷濃度在0.10～0.20 μg/mL范圍時， 其作用原理同（1）和（2），樣品液中的三唑磷消耗了一部分金標(biāo)抗體形成復(fù)合物，而剩余的金標(biāo)抗體優(yōu)先與T1線的包被原結(jié)合，形成肉眼可見的紅色條帶，使得到達(dá)T2線與T3線時金標(biāo)抗體濃度不足以與T2線與T3線的包被原反應(yīng)，此時T2線與T3線完全消失 （圖2C） 。

（4）當(dāng)待檢樣品含三唑磷濃度高于0.20 μg/mL時，樣品液中的三唑磷將金標(biāo)墊中的金標(biāo)三唑磷抗體完全消耗殆盡，形成復(fù)合物，此時T1、T2、T3線均完全消失，僅C線仍然呈肉眼可見紅色 （圖2D）。

（5）當(dāng)C線沒有顏色時，無論 T 線是否有顏色，均視為無效結(jié)果。

2.5 試紙條最低檢出限

用10% 甲醇-PBS溶液分別配制不同終濃度的三唑磷標(biāo)樣，分別取100 μL用金標(biāo)試紙條檢測，將T3檢測線消失作為試紙條最低檢出限的判定標(biāo)準(zhǔn)，確定試紙條最低檢出限。

2.6 試紙條的交叉反應(yīng)

取殺螟松、對硫磷和甲基對硫磷標(biāo)樣，用10%甲醇-PBS溶液分別稀釋到最終濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg/mL，分別用試紙條檢測，考察試紙條的交叉反應(yīng)。

2.7 樣品提取液的選擇與前處理方法優(yōu)化

為簡化樣品的提取過程同時保證提取效率，分別進(jìn)行了緩沖液直接提取、不同有機(jī)溶劑提取后緩沖液稀釋、溶劑替換等過程，以GC方法[9，30]確證提取效率，比較優(yōu)化提取試劑及方法。稱取10.0 g粉碎的大米、甘藍(lán)、蘋果樣品至50 mL離心管中，制備濃度分別為0、0.05、0.10和0.20 mg/kg（每個濃度3次重復(fù)）的添加樣品。分別以10 mL甲醇、乙腈、丙酮、10%甲醇-PBS溶液振蕩提取1 min，除加10%甲醇-PBS溶液的樣品外，其余樣品分別加入1 g NaCl振蕩1 min，靜置30 min，然后以4000 r/min離心10 min， 吸取上層有機(jī)相溶液各1 mL，加入PBS溶液稀釋10倍，用于試紙條檢測；同時吸取上層有機(jī)相溶液各1 mL，氮?dú)獯蹈?，分別以10%甲醇-PBS、丙酮溶液定容至1 mL，過濾后，分別用于試紙條、GC測定。10%甲醇-PBS直接提取的溶液則直接用于試紙條的檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 膠體金粒徑和吸收光譜圖

從圖3A可見，制備的膠體金溶液的最大吸收波長為516 nm；透射電鏡圖（圖3B）顯示，膠體金顆粒粒徑均一，粒徑約為20 nm。

3.2 金標(biāo)抗體制備條件優(yōu)化

3.2.1 最佳pH值的優(yōu)化 將三唑磷單克隆抗體溶液加入到不同pH值的膠體金溶液中，測定其吸光值，當(dāng)溶液pH=8.0時，在520 nm處的吸光度最大，溶液狀態(tài)穩(wěn)定，為抗體與膠體金結(jié)合的最適pH值。

3.2.2 抗體最適標(biāo)記濃度 上述溶液中加入10% NaCl后，抗體標(biāo)記的膠體金溶液保持紅色不變，則該標(biāo)記量為最小抗體標(biāo)記量[31]。結(jié)果表明，加入抗體量為0～3 μg/mL時，離心管內(nèi)顏色呈灰褐色，當(dāng)加入抗體量為4～6 μg/mL時，離心管內(nèi)顏色呈紫紅色，當(dāng)加入抗體量為7 μg/mL時，離心管內(nèi)顏色呈紅色，此后隨著抗體量加大，管內(nèi)顏色未有明顯變化。因此，三唑磷單克隆抗體的最小標(biāo)記濃度為7 μg/mL。 選擇7.0、7.5、8.0、8.5 和9.0 μg/mL標(biāo)記濃度對膠體金進(jìn)行標(biāo)記，將T線上出現(xiàn)肉眼可見的明顯紅色的標(biāo)記濃度確認(rèn)為抗體的最佳標(biāo)記濃度。當(dāng)抗體標(biāo)記濃度≤7.5 μg/mL時，T線顏色較淺；抗體標(biāo)記濃度為8 μg/mL 時，T線顏色出現(xiàn)明顯的紅色條帶。因此，選取8 μg/mL作為抗體最佳標(biāo)記量。

3.3 免疫試紙條的優(yōu)化

將每兩條檢測線間的距離區(qū)間設(shè)置為1～5 mm，以濃度為0、0.05、0.1和0.2 μg/mL三唑磷樣品進(jìn)行測試，結(jié)果表明：所有間距變化T1線均能較好顯色，當(dāng)間距設(shè)置為3 mm時，3條檢測線均可出現(xiàn)，但T2線顏色稍淺。當(dāng)間距設(shè)置大于3 mm時，T2線顏色增強(qiáng)，但T3線顏色變?nèi)跎踔料?。?dāng)間距設(shè)置為2 mm時，3條線之間的顏色梯度肉眼觀察并不明顯。因此將T1與T2線間距設(shè)置為2 mm，T2與T3線間距設(shè)置為3 mm，3條檢測線均較好顯現(xiàn)，且顏色梯度明顯，以期達(dá)到較好的檢測靈敏度。

為了獲得多個檢測范圍，3條檢測線的顏色強(qiáng)度將隨樣品中三唑磷濃度梯度的變化而變?nèi)?，隨著濃度的增加，T3線首先將會被完全抑制消失，之后是T2線，最后是T1線。通過調(diào)整每條檢測線的包被原濃度與金標(biāo)抗體的用量，使條帶呈現(xiàn)梯度色差。

參照ELISA的“棋盤滴定法”優(yōu)化包被原濃度，并滿足以下條件：金標(biāo)結(jié)合墊中的金標(biāo)抗體完全釋放后，在8～15 min內(nèi)可完成遷移過程，遷移通過NC膜（包括背景色），3條檢測線呈現(xiàn)梯度色差，達(dá)到最佳的檢測靈敏度和最小抗體消耗量。

3.4 兩種試紙條的制備與比較

配合樣品前處理方法，制備了兩種類型的試紙條，均可基于三唑磷MRL值進(jìn)行直接判定是否超標(biāo)及濃度范圍，試紙條Ⅰ的檢測限為MRL/10 值的試紙條，可配合樣品稀釋進(jìn)行MRL值檢測判定； 試紙條Ⅱ是以MRL值為檢測限的試紙條，為可配合樣品溶劑置換或者無需處理樣品的檢測，直接判定基于MRL值是否超標(biāo)及濃度范圍，兩種試紙條均是針對三唑磷MRL值進(jìn)行檢測。

3.4.1 以1/10三唑磷MRL值為檢測限的試紙條（試紙條Ⅰ） 參照上述原理，調(diào)整試紙條Ⅰ檢測線包被原量和膠體金噴涂量，用梯度稀釋的三唑磷樣品濃度進(jìn)行檢測，獲得檢測靈度最佳的試紙條Ⅰ。優(yōu)化參數(shù)如表 1所示。

如圖4所示，試紙條在三唑磷樣品濃度為0.001 μg/mL（圖4F）時T3線顏色明顯變?nèi)?，在濃度?.005 μg/mL（圖4D）時T3檢測線則完全消失，在濃度為0.01 μg/mL（圖4C）時T2檢測線完全消失，在濃度為0.02 μg/mL（圖4B）時，3條檢測線完全消失。

基于上述檢測結(jié)果的判斷，試紙條Ⅰ對三唑磷的檢測閾值濃度為0.005、0.01和0.02 μg/mL。因此可檢測的濃度區(qū)間為<0.005 μg/mL、0.005～0.01 μg/mL、0.01～0.02 μg/mL和>0.02 μg/mL。

3.4.2 以三唑磷MRL值為檢測限的試紙條（試紙條Ⅱ）

將試紙條Ⅰ優(yōu)化調(diào)整后獲得試紙條Ⅱ，檢測靈敏度設(shè)定為GB2763中三唑磷MRL值，依次為0.05、0.1、0.2 μg/mL，并與3條檢測線一一對應(yīng)，參數(shù)如表2所示。

在基于MRL值的基礎(chǔ)上，該試紙條相較于傳統(tǒng)的試紙條可以較為準(zhǔn)確地判斷農(nóng)產(chǎn)品食品的安全性，并可確定濃度范圍，如圖5所示，當(dāng)樣品濃度在0.05、0.1和0.2 μg/mL時，相對應(yīng)的T3、T2、T1檢測線分別完全消失，而小于這3個濃度時，相對應(yīng)的檢測線不會消失。

3.5 試紙條的交叉反應(yīng)

試紙條Ⅰ與試紙條Ⅱ分別與殺螟松、對硫磷和甲基對硫磷進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，均無交叉反應(yīng)，如圖6所示。

3.6 不同提取溶劑對三唑磷提取效率的比較

基于抗體及NC 膜對有機(jī)試劑的耐受程度及簡化前處理方法、基質(zhì)干擾（或可出現(xiàn)假陽性、假陰性）的考慮，分別對有機(jī)溶劑提取液進(jìn)行了溶劑替換、PBS 稀釋10倍后直接用于試紙條的檢測，并進(jìn)行了GC方法檢測確證。結(jié)果表明，4種試劑的提取回收率由高到低依次為乙腈>丙酮>甲醇>10%甲醇-PBS，乙腈提取回收率為86.5%～98.0%， 試紙條檢測結(jié)果與GC檢測結(jié)果基本一致。因此選取乙腈為提取試劑，PBS稀釋10倍后以試紙條Ⅰ（靈敏度為0.005、0.01和0.02 μg/g）進(jìn)行檢測，或者溶劑替換后以試紙條Ⅱ（基于MRL值）進(jìn)行檢測，均可準(zhǔn)確判斷基于MRL值的農(nóng)產(chǎn)品安全性，并可根據(jù)檢測線消失情況確定其濃度范圍。兩種試紙條均表現(xiàn)出較好的有機(jī)溶劑耐受性與抗基質(zhì)干擾能力。

同時發(fā)現(xiàn)NaCl的使用對回收效果影響較大。按2.7節(jié)的方法進(jìn)行樣品加標(biāo)，提取過程中不使用NaCl，則GC檢測發(fā)現(xiàn)其回收率僅為33.2%～74.7%，試紙條檢測結(jié)果亦表明回收率較低。添加10% （m/V） NaCl后，樣品回收率可穩(wěn)定為86.5%～980%。

3.7 方法驗(yàn)證與基質(zhì)干擾影響

樣品前處理方法如前所述，乙腈提取液分別進(jìn)行了PBS緩沖液10倍稀釋和溶劑替換后，分別用于試紙條Ⅰ和Ⅱ的檢測，檢測結(jié)果如圖7所示，大米、甘藍(lán)和蘋果的基質(zhì)對試紙條檢測靈敏度均無影響，基于檢測靈敏度為0.005 mg/kg的試紙條Ⅰ，添加濃度≥0.05 mg/kg，用PBS溶液稀釋10倍后，檢測結(jié)果仍為陽性，表明試紙條對樣品基質(zhì)有較好的抗干擾能力。在溶劑替換后，試紙條Ⅱ同樣表現(xiàn)出較好的抗基質(zhì)干擾能力，基質(zhì)的干擾可以忽略。

4 結(jié) 論

配合不同的樣品前處理方法，本研究制備了兩種基于三唑磷MRL值的膠體金免疫層析試紙條，通過多個檢測區(qū)間的設(shè)定，可以較為準(zhǔn)確確定殘留濃度范圍。與目前已報道的三唑磷膠體金免疫層析試紙條檢測方法相比，本方法對三唑磷的檢測靈敏度為0.005 μg/mL，基于殘留限量值（MRL）的3條檢測線的設(shè)定，使結(jié)果判斷更為簡單直接，與常見的殺螟松，對硫磷和甲基對硫磷農(nóng)藥均無交叉反應(yīng)，特異性良好。這兩種試紙條的檢測閾值設(shè)定為國家殘留限量值0.05、0.1和0.2 μg/mg，分別與3條檢測線一一對應(yīng)，方法驗(yàn)證參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763，以大米、甘藍(lán)和蘋果作為代表性樣品，結(jié)合特定的樣品前處理方法（10倍稀釋與溶劑替換），兩種試紙條均能以三唑磷MRL值為檢測限量， 并表現(xiàn)出較好的抗基質(zhì)干擾能力，其檢測結(jié)果與儀器方法（GC）一致，適用于現(xiàn)場檢測大批量樣品。農(nóng)產(chǎn)品種類多樣，本研究中未進(jìn)行油脂類樣品的研究，其前處理提取方法更為復(fù)雜，需要不同的過程，后續(xù)仍需進(jìn)行更多農(nóng)產(chǎn)品種類驗(yàn)證，樣品提取與前處理方法的驗(yàn)證與優(yōu)化，擴(kuò)大試紙條的適用范圍。

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Abstract A novel immunochromatographic assay was developed， which could provide visual evidence of triazophos in agro products， and also could directly identify the safety status by setting visual cut-off limit of detection in maximal residual limit （MRL） value. Three test lines （T1， T2， T3） were applied to the nitrocellulose membrane with different concentrations of Triazophos-OVA， and one control line （C） was settled with goat anti mouse IgG antibody. Thereafter， by combining with conjugate pad which immobilized monoclonal antibody labeled with 20 nm Colloidal gold particles， absorbent pad and PVC plate， a chromatographic test strip was assembled. With optimization of sample extraction and solvents selection， the test strips were employed for the determination of triazophos in rice， cabbage and apple. The results revealed that the cut-off limit of detection could reach 0.005， 0.01 and 0.02 μg/mL represented by test line T3， T2 and T1， respectively. After modification， the cut-off limit of detection was resettled to 0.05， 0.1 and 0.2 μg/mL according to the MRL values which enforced by the national standard of GB2763. Using acetonitrile for the sample extraction， the extracts were diluted 10 times or solvent exchanged with equivalent volume by PBS solution， and then tested by strips descripted above mentioned. The two test strips could precisely identified the safety status of agro product with MRL as threshold within 8-12 min. Furthermore， the residues value of triazophos could be quantified by the multiple quantitative test lines. Parallel GC data indicated that the strip had no false negative. This MRL-based multiple quantitative triazophos detection strip would provide a simple， direct， accurate and the most intuitionistic performance for the evaluation of agro product safety.

Keywords Triazophos； Immunochromatographic assay； Maximal residual limit value； Rapid detection

（Received 28 September 2017； accepted 24 March 2018）