乳酸菌胞外多糖結(jié)構(gòu)解析的研究方法

邸維 張英春 易華西 韓雪 王淑梅 張?zhí)m威

摘 要 乳酸菌胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤、改善食品質(zhì)地和口感等多種獨(dú)特的功能特性，其分子結(jié)構(gòu)多樣性是影響功能的主要因素之一。乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)解析是研究其功能性和構(gòu)效關(guān)系的前提和基礎(chǔ)。本文根據(jù)乳酸菌胞外多糖結(jié)構(gòu)解析過程中的關(guān)鍵步驟，總結(jié)了乳酸菌胞外多糖的分離純化、初級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)方法的研究進(jìn)展，討論了化學(xué)分析、儀器分析以及計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)等多元技術(shù)方法在乳酸菌胞外多糖結(jié)構(gòu)解析領(lǐng)域的綜合運(yùn)用，并對(duì)乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)研究的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 乳酸菌； 胞外多糖； 分離純化； 結(jié)構(gòu)解析； 評(píng)述

1 引 言

多糖廣泛存在于高等植物、細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，是生命有機(jī)體的重要組成成分。多糖不僅可為生命體提供能量，同時(shí)還參與生命科學(xué)中細(xì)胞的多種活動(dòng)，并具有多種生物活性。因此，近幾十年來關(guān)于多糖的活性和結(jié)構(gòu)研究逐漸成為相關(guān)學(xué)科的前沿研究領(lǐng)域。胞外多糖（Exopolysaccharides， EPSs）作為乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，其功能性已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和認(rèn)可[1，2]。乳酸菌對(duì)人體安全無毒（Generally regarded as safe，GRAS），所分泌的胞外多糖（LAB-EPSs）具有獨(dú)特的理化特性，可作為穩(wěn)定劑、增稠劑或乳化劑等， 用于改善食品的質(zhì)地和口感[3]；此外，乳酸菌胞外多糖還具有抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗菌[7]等多種生物活性，可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[8]。

LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)是決定其功能的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)效關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[9，10]。LAB-EPSs的分子量相對(duì)較大，通常在104～106 Da之間，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，具有多態(tài)性，因此其結(jié)構(gòu)解析較一般細(xì)菌多糖和真菌多糖更為困難，尤其是對(duì)其結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化檢測的研究相對(duì)有限，增加了LAB-EPSs結(jié)構(gòu)解析的難度[11，12]。此外，LAB-EPSs由多種不同電荷性質(zhì)和分子量的EPSs組分混合而成，研究LAB-EPSs結(jié)構(gòu)的前提是獲得均一性的EPSs組分，因此，分離純化方法也是LAB-EPSs結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的重要方面[13]。

近年來，隨著新型分析技術(shù)手段的不斷涌現(xiàn)，為LAB-EPSs的分離純化和結(jié)構(gòu)解析提供了更多啟示和實(shí)例[14]。本文對(duì)LAB-EPSs的分離純化方法、一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定方法、以及計(jì)算機(jī)程序CASPER（Computer assisted spectrum evaluation of regular polysaccharides）結(jié)合核磁共振（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）在LAB-EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)解析方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為LAB-EPSs的應(yīng)用性基礎(chǔ)研究提供參考。

2 乳酸菌胞外多糖的分離純化

對(duì)LAB-EPSs進(jìn)行分離純化獲得均一組分是結(jié)構(gòu)解析研究的前提。目前，LAB-EPSs的分離純化通常采用離心除去細(xì)菌體，酶法脫蛋白，有機(jī)溶劑沉淀得到粗EPSs，再通過柱層析純化獲得均一性的EPSs組分，并對(duì)所得EPSs組分的純度進(jìn)行分析鑒定[15，16]。近年來，LAB-EPSs的分離純化效果隨著層析技術(shù)的不斷發(fā)展而得到明顯提升。通常，LAB-EPSs的柱層析純化多先采用DEAE-瓊脂糖凝膠FF（DEAE-Sepharose Fast-Flow）層析對(duì)粗多糖中不同電荷性質(zhì)的EPSs組分進(jìn)行初步分離，然后采用凝膠層析對(duì)相同電荷性質(zhì)的EPSs組分按分子量的不同進(jìn)一步純化，獲得均一性EPSs組分，為后續(xù)結(jié)構(gòu)解析提供良好的實(shí)驗(yàn)樣品。

DEAE-Sepharose Fast-Flow層析具有流速快、高載量、穩(wěn)定性好和可再生次數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)LAB-EPSs大多為酸性多糖的特點(diǎn)，近年來常用于對(duì)其進(jìn)行初步分離純化[17]。初步純化所得的EPSs可通過凝膠層析法進(jìn)一步純化，獲得分子量相同的均一組分。凝膠層析不僅可根據(jù)分子量的不同將LAB-EPSs進(jìn)一步分離純化，同時(shí)能通過洗脫產(chǎn)物單一尖銳的峰形判定純度，得到可供結(jié)構(gòu)解析的均一EPSs組分[18]。Li等[5]利用DEAE-Sepharose Fast-Flow對(duì)植物乳桿菌LP6（L. plantarum）所產(chǎn)的粗EPSs進(jìn)行純化，得到兩個(gè)中性（EPS-1和EPS-2）和一個(gè)酸性（EPS-3）EPSs組分，采用Sepharose CL-6B將EPS-3組分進(jìn)一步純化得到均一的EPSs組分。Miao等[19]采用DEAE-Sepharose Fast-Flow層析先將羅伊氏乳桿菌SK24.003（L. reuteri）所產(chǎn)的粗EPSs純化為一個(gè)中性和一個(gè)酸性EPSs組分，然后采用Sepharose CL-2B對(duì)這兩個(gè)組分進(jìn)一步純化，獲得單一尖銳峰形的均一EPSs組分，最后通過NMR技術(shù)分析該組分的結(jié)構(gòu)特征。近年來，隨著全自動(dòng)蛋白純化系統(tǒng)和NGC中高壓層析系統(tǒng)等層析技術(shù)的不斷發(fā)展，為LAB-EPSs的分離純化提供了更加精準(zhǔn)、高效和便捷的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

3 乳酸菌胞外多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究

LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)等）。一級(jí)結(jié)構(gòu)包括糖基的組成、連接順序、構(gòu)型、羥基被取代情況和糖苷鍵的異頭異構(gòu)形式、糖鏈的分支、位置以及長短等，通常采用化學(xué)方法和儀器分析方法相結(jié)合對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

3.1 化學(xué)分析法

LAB-EPSs一級(jí)結(jié)構(gòu)研究的傳統(tǒng)化學(xué)分析方法包括酸水解、高碘酸氧化、Smith降解和甲基化反應(yīng)等，主要用于測定LAB-EPSs的單糖組成和比例，初步判斷糖苷鍵連接方式和位置等，是儀器分析方法的基礎(chǔ)。其中，酸水解主要用于確定各單糖的組成[20]，高碘酸氧化反應(yīng)可根據(jù)高碘酸的消耗量和甲酸的生成量可判斷糖苷鍵的位置、連接方式、分支度或聚合度等結(jié)構(gòu)信息[21，22]。Smith降解可測定單糖的種類、連接方式和順序以及氧環(huán)大小[23]。與上述方法相比，甲基化法在LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)解析中更為常用，該方法不僅較其他方法對(duì)樣品需求量小，可確定單糖的種類和比例、各糖苷鍵的連接方式和位置，還可通過傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer， FT-IR）檢驗(yàn)甲基化是否成功。但甲基化法無法對(duì)異頭碳糖苷鍵構(gòu)型和糖鏈中單糖殘基的順序信息進(jìn)行測定[24]。然而，將甲基化的分析結(jié)果進(jìn)一步結(jié)合NMR圖譜可以彌補(bǔ)甲基化分析法的不足，且能更為直接地獲得LAB-EPSs的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。Wang等[25]通過甲基化和一維NMR圖譜（1D-NMR）確定了L. plantarum 70810所產(chǎn)EPSs主鏈和側(cè)鏈的連接方式。Polak-Berecka等[26]研究5種不同碳源培養(yǎng)基對(duì)鼠李糖乳桿菌E/N（L. rhamnosus）所產(chǎn)EPSs結(jié)構(gòu)的影響，通過甲基化、1D-NMR、ROESY和HMBC等2D-NMR確定了該5種EPSs糖苷鍵主鏈和側(cè)鏈的連接方式及順序。

3.2 儀器分析法

目前，常用于LAB-EPSs一級(jí)結(jié)構(gòu)測定的儀器分析法包括凝膠柱層析、排阻色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、FT-IR以及NMR等[27]，儀器分析法可與化學(xué)分析法相輔相成，互相補(bǔ)充，提供更全面的信息。

3.2.2 NMR法 NMR在解析LAB-EPSs的糖苷鍵構(gòu)型、氧環(huán)大小、單糖的種類和相對(duì)比例、糖鏈的連接位置和順序等方面具有重要作用[11]。常用方法主要有1H-NMR、13C-NMR和二維NMR（2D-NMR）等。在LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)測定中，1H-NMR主要用于解決糖苷鍵構(gòu)型問題，根據(jù)不同糖苷鍵構(gòu)型特征將其特性進(jìn)行區(qū)別[35]。13C-NMR既可確定各種碳的位移，以及單糖殘基的種類、比例、取代位置和分支點(diǎn)，還能區(qū)別構(gòu)型和構(gòu)象，對(duì)于LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)解析起到?jīng)Q定性作用[36]。Doco等[37]最早將NMR技術(shù)引入LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域，采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)和1H-/13C-NMR等方法測定一株嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）所產(chǎn)EPSs的結(jié)構(gòu)，并獲得了該EPSs組分的主鏈連接順序和方式（圖2A）。隨著1D-NMR技術(shù)在EPSs結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，一些結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單的均一LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)特征被相繼報(bào)道[38～40]。

2D-NMR可對(duì)LAB-EPSs的1H和13C-NMR譜進(jìn)行完全歸屬，進(jìn)而獲得LAB-EPSs的全部一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。此外，將NMR圖譜與甲基化分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，還可避免NMR譜圖中一些噪聲峰和雜質(zhì)峰的干擾[41]。Górska-Fraczek等[6]通過1D-和2D-NMR（COSY， TOCSY， NOESY， HSQC和HMBC）結(jié)合甲基化分析結(jié)果，對(duì)約氏乳桿菌151（L. johnsonii）所產(chǎn)EPSs的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明，該EPSs是由重復(fù)單元構(gòu)成的線性多糖（圖2B）。同時(shí)1D-和2D-NMR也可測定解析具有支鏈結(jié)構(gòu)的LAB-EPSs組分的結(jié)構(gòu)特征，Gerwig等[42]利用高碘酸氧化、甲基化分析、1D-和2D-NMR等方法，分析發(fā)酵乳桿菌TDS030603（L. fermentum）所產(chǎn)EPSs的一級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該EPSs的主鏈?zhǔn)怯伤奶侵貜?fù)單元構(gòu)成，并具有不均一的半乳糖側(cè)鏈（圖2C）。

然而，對(duì)于一些分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的LAB-EPSs，通過化學(xué)方法結(jié)合1D-和2D-NMR也不能完全解析其結(jié)構(gòu)。Ai等[43]通過FT-IR、甲基化和1D-/2D-NMR等方法對(duì)干酪乳桿菌LC2W（L. casei）所產(chǎn)LCP1胞外多糖組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，通過結(jié)果分析得出LCP-1組分的主鏈結(jié)構(gòu)并推斷出其中一個(gè)支鏈的可能構(gòu)型（圖2D）。近年來，隨著HMQC-COSY、HMQC-TCOSY、HMQC-TOCSY、HMQC-NOESY等混合多量子譜的發(fā)展，可用于解決LAB-EPSs復(fù)雜的結(jié)構(gòu)解析中不能用COSY或HMQC進(jìn)行準(zhǔn)確歸屬的問題，是今后對(duì)LAB-EPSs復(fù)雜結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析研究的重要方向[44]。

4 乳酸菌胞外多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)研究

LAB-EPSs的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指一級(jí)糖鏈在有序的空間里卷曲折疊形成的有規(guī)則的空間構(gòu)象[45，46]。其中，多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多糖主鏈間以氫鍵結(jié)合而形成的聚合體，主要依賴其一級(jí)結(jié)構(gòu)的排布；多糖的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)則是以二級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，由糖單位的非共價(jià)相互作用，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)在有序的空間里產(chǎn)生有規(guī)則的構(gòu)象[47]。由于LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)較蛋白質(zhì)、核酸等其它生物大分子更為復(fù)雜，且其空間結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，尤其目前對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的表征技術(shù)手段十分有限。因此，對(duì)LAB-EPSs的高級(jí)結(jié)構(gòu)研究仍處于起步階段，主要表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)測定不夠自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化和微量化[20]。隨著大型精密儀器檢測、計(jì)算機(jī)輔助信息化等技術(shù)在LAB-EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，有關(guān)其高級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理、動(dòng)態(tài)的圖譜解析等技術(shù)難題得到不斷優(yōu)化。

LAB-EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)分析的常用方法主要包括X射線衍射法（XRD）、原子力顯微鏡法（AFM）、高效液相色譜（HPLC）與基于高分子稀溶液理論（動(dòng)＼＼靜態(tài)光散射或黏度測定等）的聯(lián)用技術(shù)、圓二色譜法（CD）等[48]。目前，該方面研究的最新進(jìn)展主要集中于借助計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)、光散射技術(shù)以及掃描電鏡法等對(duì)其復(fù)雜結(jié)構(gòu)模型的推導(dǎo)、多態(tài)性特征檢測以及形態(tài)學(xué)特征輔助驗(yàn)證等[40]。

4.1 計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)

由于LAB-EPSs內(nèi)部均一性相對(duì)較差，數(shù)據(jù)處理及圖譜解析難度大，當(dāng)前對(duì)于其高級(jí)結(jié)構(gòu)研究主要集中于一級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單均一的EPSs組分，而對(duì)于單糖組成較多、連接方式復(fù)雜的雜多糖涉獵有限[48]。近年來，計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)在LAB-EPSs結(jié)構(gòu)的NMR解譜分析領(lǐng)域應(yīng)用發(fā)展較快，Lundborg 等[49]建立了計(jì)算機(jī)輔助液態(tài)NMR圖譜解析技術(shù)，可通過比對(duì)圖譜和計(jì)算耦合常數(shù)，對(duì)糖蛋白上的糖鏈及部分細(xì)菌多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。Jansson等[50]開發(fā)的計(jì)算機(jī)程序CASPER可通過數(shù)據(jù)庫中已存的EPSs的單糖、二糖和三糖的1H-和13C-NMR化學(xué)位移數(shù)據(jù)預(yù)測簡單均一的未知EPSs的結(jié)構(gòu)波譜。近年來，CASPER已開發(fā)出擴(kuò)展版本，增加了多種單糖的1H-和13C-NMR化學(xué)位移和部分多糖的2D-NMR數(shù)據(jù)信息，大大提高了復(fù)雜多糖結(jié)構(gòu)測定的成功率[51]。Fontana等[52]將L. plantarum C88所產(chǎn)EPSs的1H-NMR、13C-NMR和乙?；瘮?shù)據(jù)輸入CASPER程序中，不僅快速準(zhǔn)確的推導(dǎo)出C88-EPSs的雙分支糖結(jié)構(gòu)，同時(shí)確定了乙酰基取代基的確切位置。因此，計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)將越來越多地應(yīng)用于LAB-EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)測定的研究，并與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)LAB-EPSs結(jié)構(gòu)進(jìn)行更為精準(zhǔn)、快捷的解析研究。

4.2 光散射技術(shù)

由于LAB-EPSs的高級(jí)結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性的特征，傳統(tǒng)測度方法具有局限性，而多角度激光光散射儀、多角度靜態(tài)光散射儀、動(dòng)態(tài)光散射儀等成為目前獲得LAB-EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)的簡單有效方法[48]。這些方法可通過散射光的強(qiáng)度變化和位移分布計(jì)算，得到LAB-EPSs的空間構(gòu)象[53]。Shao等[54]利用多角度激光光散射（SEC-MALLS）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）檢測L. rhamnosus KF5所產(chǎn)EPSs組分S2在溶液中的形態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)S2-EPSs組分在0.1 mol/L NaNO3溶液中糖鏈呈柔順的隨機(jī)線形構(gòu)象，且通過原子力顯微鏡（AFM）觀察也證實(shí)這一結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，DLS還可用于研究LAB-EPSs的流變學(xué)特性，推動(dòng)LAB-EPSs在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。 Ayala-Hernandez等[55]通過DLS研究了乳酸乳球菌乳脂亞種JFR1（Lactococcus lactis subsp. cremoris）所產(chǎn)EPSs在乳清蛋白中與膠體顆粒的相互作用，結(jié)果表明該EPSs組分帶負(fù)電荷，可與乳清蛋白中的膠體顆粒在酸性條件下相互作用，增加牛奶和乳制品等膠體體系的粘度。

4.3 電鏡法

近年來，LAB-EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征引起學(xué)者的關(guān)注，形態(tài)學(xué)特征是反映LAB-EPSs結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[56]。掃描電鏡法（SEM）可用于觀察并獲得EPSs的原始形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。Ahmed[16]和Liu[40]等均對(duì)LAB中分離純化出的EPSs進(jìn)行SEM拍攝，通過觀察獲得其薄片狀、致密性的表面特征用于輔助推測其結(jié)構(gòu)的完整性等特征。隨后，Saravanan等[31]將SEM拓?fù)鋱D與原子力顯微鏡（AFM）獲得的數(shù)據(jù)相結(jié)合，對(duì)LAB-EPSs的內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密狀態(tài)進(jìn)行定量測度，證明了具有致密性表面形態(tài)的EPSs同時(shí)也具有物理穩(wěn)定性，從而證實(shí)了表面形態(tài)特征與EPSs的微觀結(jié)構(gòu)特征具有直接關(guān)聯(lián)。此外，Di等[57]對(duì)L. casei SB27所產(chǎn)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的EPSs組分LW1和LW2的表面形態(tài)學(xué)和理化特性進(jìn)行對(duì)比研究，SEM圖顯示，LW1和LW2多糖組分均呈薄片狀并具有致密性的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合甲基化和FT-IR等結(jié)果說明，具有相似微觀結(jié)構(gòu)的EPSs可能具有相似的表面特征和理化特性。借助物理技術(shù)等新技術(shù)方法可擴(kuò)充常規(guī)方法對(duì)LAB-EPSs結(jié)構(gòu)研究的認(rèn)識(shí)維度，從而為其結(jié)構(gòu)研究提供更多的輔助性信息，是EPSs高級(jí)結(jié)構(gòu)研究的重要趨勢(shì)。

5 總結(jié)與展望

精確測定和解析LAB-EPSs結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵是獲得定量且純度高的均一組分樣品，并克服動(dòng)態(tài)的數(shù)據(jù)處理與復(fù)雜圖譜解析等難題。傳統(tǒng)化學(xué)方法結(jié)合NMR技術(shù)，以及NMR與計(jì)算機(jī)輔助分析技術(shù)相結(jié)合，可從多角度綜合分析LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)特征。隨著計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)的發(fā)展，借助系統(tǒng)數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)LAB-EPSs結(jié)構(gòu)的分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬、預(yù)測、解析等角度的擴(kuò)展研究，為闡明LAB-EPSs的結(jié)構(gòu)特征提供精準(zhǔn)依據(jù)，將是LAB-EPSs結(jié)構(gòu)研究的前沿方向。此外，隨著對(duì)LAB-EPSs結(jié)構(gòu)解析研究的深入，對(duì)其構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制的研究將得到進(jìn)一步充實(shí)，并奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，對(duì)LAB-EPSs理化特征的精準(zhǔn)調(diào)控能力也將得到不斷提升，推動(dòng)LAB-EPSs在醫(yī)療、食品、動(dòng)物生物、環(huán)境治理等諸多領(lǐng)域進(jìn)行廣泛應(yīng)用。

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Abstract Exopolysaccharides （EPSs）， produced by lactic acid bacteria （LAB）， have been used primarily to improve the quality and taste of food， also possess a variety of unique biological functions， such as immunoregulation and anti-tumor activities. The diversity of molecular structural characteristics of LAB-generated EPSs represents one of the main factors responsible for this plethora of functions. Accordingly， the structural analysis of the EPSs produced by LAB is both a prerequisite and basis for examining its functional and structure-activity relationships. In this article， we summarized the current progress of key methodologies involved in the structural analysis of LAB-generated EPSs， including their isolation， purification， primary structure and advances in structural research. A comprehensive discussion regarding the application of chemical analysis， instrument analysis and computer aided technology in the structure analysis of LAB-generated EPSs was provided. Further， the future development of the research on the structure of LAB-generated EPSs was presented.

Keywords Lactic acid bacteria； Exopolysaccharides； Isolation and purification； Structure analysis； Review

（Received 21 March 2018； accepted 8 April 2018）