發(fā)卡型萬(wàn)能傳導(dǎo)在基于核酸分子線路的基因診斷中的應(yīng)用和性能優(yōu)化

唐藝丹 劉一辰 呂佰陽(yáng) 郭路路 李冰凌

摘 要 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定溫度下。與聚合酶鏈反應(yīng)相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)具有優(yōu)異的便攜型，因而被視為最有望實(shí)現(xiàn)基因快檢甚至即時(shí)快檢的體外基因擴(kuò)增方法。然而，由于反應(yīng)過(guò)程中假陽(yáng)性擴(kuò)增頻發(fā)、反應(yīng)后對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)方法缺乏特異性和靈敏度等缺點(diǎn)，限制了其在實(shí)際分析檢測(cè)中的應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建發(fā)卡型結(jié)構(gòu)萬(wàn)能中轉(zhuǎn)探針，成功地將恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)到一套性能良好的已知核酸分子線路上；借助核酸分子線路的百倍放大性能和序列特異性，實(shí)現(xiàn)對(duì)上游基因序列信息的精準(zhǔn)識(shí)別和放大信號(hào)輸出。針對(duì)不同的待測(cè)序列，僅需改變發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針的序列，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同序列目標(biāo)物的檢測(cè)?；谥修D(zhuǎn)探針的重要性，本研究對(duì)中轉(zhuǎn)探針的設(shè)計(jì)原理和方法進(jìn)行了重點(diǎn)闡述，提出并驗(yàn)證了一套行之有效的普適性設(shè)計(jì)規(guī)律，確保中轉(zhuǎn)探針良好的中轉(zhuǎn)效率（信噪比）。利用這一規(guī)律獲得的中轉(zhuǎn)探針，與核酸分子線路偶聯(lián)，可成功為低至近單分子（20個(gè)拷貝）的模型基因提供顯著熒光和電化學(xué)信號(hào)輸出。

關(guān)鍵詞 等溫?cái)U(kuò)增； 萬(wàn)能中轉(zhuǎn)； 發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針； 核酸分子線路； 催化發(fā)卡型結(jié)構(gòu)自組裝； 熒光； 電化學(xué)

1 引 言

基因診斷是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病患特定基因片段進(jìn)行定量或定性分析的檢測(cè)方法。由于病原體基因含量通常極低，因此對(duì)基因片段進(jìn)行高效擴(kuò)增，是對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和分析的首要步驟。目前，以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）為代表的熱循環(huán)核酸擴(kuò)增反應(yīng)和一系列恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，被認(rèn)為是功能最為強(qiáng)大的核酸擴(kuò)增體系。恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)包括滾環(huán)放大（RCA）[1]、自主序列復(fù)制擴(kuò)增（3SR）[2]、依賴于核酸序列擴(kuò)增（NASBA）[3]、鏈替換擴(kuò)增（SDA）[4]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）[5]、解旋酶替換擴(kuò)增（HAD）[6]、重組酶復(fù)制擴(kuò)增（RPA）[7]等。在這一系列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，日本Eiken Chemical公司于2000年發(fā)明了LAMP技術(shù)[5]（圖1，STEP I），使用一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶和4條特征性引物，可在恒定溫度（（65±5）℃）下實(shí)現(xiàn)對(duì)雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA模板序列的109～1010倍擴(kuò)增。因此，該技術(shù)自發(fā)明以來(lái)一直被視為PCR最有力的競(jìng)爭(zhēng)者和最具即時(shí)診斷（POC）兼容性的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。盡管如此，LAMP的實(shí)際應(yīng)用依然受到“可靠性低”的嚴(yán)重制約[8～13]。原因是在恒溫條件下，核酸擴(kuò)增反應(yīng)失敗率（假陰性）和非特異性（假陽(yáng)性）激增；而目前普遍使用的表征方法（如凝膠電泳、熒光染色、共沉淀、雙引物標(biāo)記比色法等）僅能識(shí)別堿基對(duì)的增加，并不能有效辨別正確的擴(kuò)增序列，易發(fā)生誤診和漏診。這也是目前阻礙各種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要因素。

無(wú)酶核酸分子線路是通過(guò)控制核酸鏈交換反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)而建立的核酸分子工程新方向[14～18]，該理論證明單個(gè)或多個(gè)單鏈DNA輸入存在下可引發(fā)一系列并聯(lián)或串聯(lián)的鏈交換反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)線性或指數(shù)循環(huán)放大效果，且整個(gè)過(guò)程不需要任何蛋白質(zhì)輔助。最具代表性的無(wú)酶分子線路包括雜交鏈反應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）[19，20]。 熵驅(qū)動(dòng)反應(yīng)（Entropy driven reaction）[21]和催化發(fā)卡型結(jié)構(gòu)自組裝（Catalytic hairpin assembly，CHA）反應(yīng)[22，23]。在CHA反應(yīng)中，一條線性DNA輸入（C1）通過(guò)兩次核酸鏈交換依次打開(kāi)并組裝兩條序列互補(bǔ)、但雜交受限的發(fā)卡型DNA（H1和H2）；每完成一次組裝，C1可自發(fā)脫離組裝體（H1-H2），作為催化劑再次參與另一次組裝過(guò)程[23]。相比于一步鏈交換，CHA明顯的優(yōu)勢(shì)在于具有50～100倍放大功能；信噪比高，可程序化；對(duì)錯(cuò)配響應(yīng)更加靈敏和特異；產(chǎn)物簡(jiǎn)單且?guī)в袉捂?，可靈活、簡(jiǎn)便地偶聯(lián)到下游熒光、電化學(xué)和比色等常規(guī)檢測(cè)器中[23]。基于上述獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，CHA已作為新一代的信號(hào)放大和傳感元件被用于多種分析應(yīng)用中[24～27]。

在前期工作中，本課題組已證明將CHA作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增反應(yīng)與下游信號(hào)輸出間的智能傳導(dǎo)元件，能夠克服上述LAMP假性信號(hào)頻發(fā)的缺點(diǎn)和不足[12，28]。LAMP擴(kuò)增后的環(huán)狀單鏈產(chǎn)物一般含有25～35個(gè)堿基，可將其直接作為催化劑C1設(shè)計(jì)CHA的反應(yīng)組分H1、H2和F-Q報(bào)告探針。CHA的特征性傳導(dǎo)可以精準(zhǔn)地識(shí)別待測(cè)序列，在完全排除假陽(yáng)性誤診的前提下進(jìn)一步放大信號(hào)幅度，降低假陰性檢出率。然而，該方法在檢測(cè)新的待測(cè)基因時(shí)需重新設(shè)計(jì)CHA組分和反應(yīng)，過(guò)程繁瑣復(fù)雜。由于大多數(shù)基因片段含有自折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得CHA反應(yīng)的高效性也難以保證。本研究以提高方法普遍適用性為目的，提出基于“發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針”的“萬(wàn)能傳導(dǎo)”策略[12]。其主旨是將一套高效CHA反應(yīng)的C1封閉在發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針的莖部，使其無(wú)法誘導(dǎo)CHA反應(yīng)；只有當(dāng)中轉(zhuǎn)探針被LAMP環(huán)狀產(chǎn)物打開(kāi)時(shí)，C1才被游離出來(lái)，開(kāi)啟有效的CHA反應(yīng)。利用這種策略，檢測(cè)方式由直接檢測(cè)LAMP產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)闄z測(cè)一套高效CHA的C1；因此針對(duì)不同的待測(cè)序列，只需更換發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。雖然此方法的可行性已在前期工作中得到驗(yàn)證，但后續(xù)研究表明，發(fā)卡型探針的設(shè)計(jì)過(guò)程復(fù)雜且失敗率高； 打開(kāi)率低或封閉效率低的發(fā)卡探針會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)CHA對(duì)LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，信噪比無(wú)法達(dá)到預(yù)期水平。因此，本研究將對(duì)發(fā)卡型探針的設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法進(jìn)行詳細(xì)討論，總結(jié)出一套行之有效的設(shè)計(jì)規(guī)律，從而實(shí)現(xiàn)CHA對(duì)基因的超靈敏、超特異和超普適分析。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)模型基因（大腸桿菌的malB基因片段）的超特異檢測(cè)，檢測(cè)限低至20個(gè)拷貝，完全滿足實(shí)際需求。

實(shí)驗(yàn)中所使用的緩沖液包括：1 × TNaK 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5），含140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl； 1 × 等溫?cái)U(kuò)增緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.8），含10 mmol/L （NH4）2SO4、50 mmol/L KCl、2 mmol/L MgSO4、0.1% Tween 20；電解質(zhì)緩沖溶液I-Buffer（pH 7.4）：10 mmol/L Tris-HCl溶液、1 mmol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司超純水機(jī)制備）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針-CHA反應(yīng)檢測(cè) 不同濃度模擬LAMP產(chǎn)物（Target和Target 2）配制體系為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L （NH4）2SO4、50 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、0.1% Tween 20、甜菜堿終濃度為1 mol/L。取12 μL Target或Target 2加入22.2 nmol/L 中轉(zhuǎn)探針（Transducer），退火5 min（即95℃孵育5℃后，以0.1℃/min 降溫至37℃）。以1∶1∶1∶1的體積比加入Target-Transducer混合物、200 nmol/L H1、800 nmol/L H2、200 nmol/L報(bào)告基因（包括200 nmol/L F和400 nmol/L Q）。反應(yīng)液中Mg2+終濃度為5 mmol/L。

2.2.2 LAMP等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) 以帶有目標(biāo)基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，25 μL LAMP反應(yīng)體系為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L （NH4）2SO4、50 mmol/L KCl、4 mmol/L MgSO4、0.1% Tween 20，其中內(nèi)引物FIP/BIP濃度為0.8 μmol/L，外引物F3/B3濃度為0.2 μmol/L，甜菜堿濃度為1 mol/L，dNTPs終濃度為0.4 mmol/L，將24 μL混合液退火5 min，最后加入1 μL（120 U）Bst 2.0 DNA聚合酶。反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為90 min，最后80℃熱處理20 min 終止反應(yīng)。

2.2.3 LAMP-發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針-CHA反應(yīng)檢測(cè) 在12 μL LAMP反應(yīng)物中加入終濃度為20 nmol/L Transducer 3，95℃退火5 min，以1∶1∶1∶1的體積比加入LAMP擴(kuò)增子-Transducer 3混合物、200 nmol/L H1、800 nmol/L H2、200 nmol/L報(bào)告基因（包括200 nmol/L F和400 nmol/L Q）。反應(yīng)液中Mg2+終濃度為5 mmol/L。

2.2.4 電化學(xué)檢測(cè) 電化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中所用電極為新型PEG（Plastic-gold electrode）芯片電極[29]，三電極均為金電極的體系。電極以0.1 mol/L H2SO4清洗后，修飾HS-P巰基探針，并用MCH進(jìn)行封閉。在12 μL LAMP反應(yīng)物中加入終濃度為20 nmol/L Transducer 3，95℃退火5 min，以1∶1∶1∶1的體積比加入LAMP擴(kuò)增子-Transducer 3混合物、800 nmol/L H1-MB、800 nmol/L H2和緩沖溶液。在37℃反應(yīng)2 h后，將20 μL溶液滴在HS-P/MCH修飾的金電極表面，于37℃反應(yīng)1 h后，用電解質(zhì)緩沖溶液I-Buffer清洗電極，并在I-Buffer溶液中進(jìn)行SWV電化學(xué)測(cè)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 CHA反應(yīng)歷程

如圖1（STEP Ⅲ）所示，CHA反應(yīng)基本組分為兩個(gè)序列部分互補(bǔ)的發(fā)卡型DNA（簡(jiǎn)稱H1和H2）。由于互補(bǔ)序列均被發(fā)卡結(jié)構(gòu)封閉，因此二者反應(yīng)動(dòng)力學(xué)嚴(yán)重受阻，無(wú)法自發(fā)雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在加入引發(fā)劑C1（僅3-2-1部分）后，C1的區(qū)域1片段會(huì)作為立足點(diǎn)，識(shí)別H1的粘性末端1*，隨即開(kāi)啟鏈遷移反應(yīng)，打開(kāi)H1，形成C1-H1雜交體。C1-H1中暴露出的區(qū)域3會(huì)作為立足點(diǎn)識(shí)別H2的粘性末端區(qū)域3*，進(jìn)而引發(fā)第二次鏈遷移反應(yīng)，形成C1-H1-H2中間產(chǎn)物。在該中間產(chǎn)物中，C1與H1只有8個(gè)堿基互補(bǔ)，因此無(wú)法穩(wěn)定雜交[23，30]，會(huì)自發(fā)從H1上脫落，生成反應(yīng)終產(chǎn)物H1-H2雜交體。而脫落的C1則會(huì)再次識(shí)別未反應(yīng)的H1，參與下一輪H1-H2自組裝反應(yīng)。為表征反應(yīng)進(jìn)程，H1-H2雜交體中暴露的區(qū)域2會(huì)與區(qū)域5-6一起再次開(kāi)啟另一次基于立足點(diǎn)的鏈遷移反應(yīng)，將標(biāo)記有淬滅集團(tuán)的探針Q從標(biāo)有熒光集團(tuán)的F上置換掉，最終產(chǎn)生可以檢測(cè)到的熒光增強(qiáng)信號(hào)。由反應(yīng)歷程可見(jiàn)，C1能否與H1作用的關(guān)鍵在于區(qū)域1是否處于非封閉的自由狀態(tài)。

3.2 LAMP-發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針-CHA的檢測(cè)原理

通過(guò)發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針將LAMP產(chǎn)物傳導(dǎo)至上述CHA檢測(cè)的原理如圖1，可分解為3個(gè)步驟： 在55～60℃的恒溫條件下對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行LAMP擴(kuò)增（圖1，STEP I）； LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針作用，打開(kāi)發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針的莖部，釋放出原本被發(fā)卡型探針?lè)忾]的CHA催化劑C1（圖1，STEP Ⅱ）； C1開(kāi)啟CHA反應(yīng)（圖1，STEP Ⅲ）。

整個(gè)原理的核心部分是發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針對(duì)LAMP產(chǎn)物和下游CHA的中轉(zhuǎn)效率。由上述CHA工作原理可知，C1能否與H1作用的關(guān)鍵在于區(qū)域1是否處于非封閉的自由狀態(tài)。因此，發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針設(shè)計(jì)的核心思想即是將C1的區(qū)域1包埋（封閉）在發(fā)卡型探針的莖部，使其無(wú)法再行使立足點(diǎn)的功能。而如果將發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針的環(huán)部設(shè)計(jì)成LAMP某一環(huán)狀產(chǎn)物的互補(bǔ)序列，則可利用環(huán)狀產(chǎn)物與探針環(huán)部的雜交作用強(qiáng)制性打開(kāi)中轉(zhuǎn)探針的莖部，從而游離出C1的區(qū)域1，進(jìn)而開(kāi)始CHA反應(yīng)。

3.3 發(fā)卡型探針的設(shè)計(jì)和優(yōu)化

鑒于上述檢測(cè)原理和設(shè)計(jì)思想，中轉(zhuǎn)探針的中轉(zhuǎn)效率主要取決于兩個(gè)因素：封閉效率和打開(kāi)效率。前者是發(fā)卡探針是否能有效封閉C1的區(qū)域1，決定檢測(cè)背景噪音；后者則是LAMP是否能高效打開(kāi)中轉(zhuǎn)探針，決定檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。為方便優(yōu)化，本研究首先以一條線性單鏈DNA模擬LAMP單鏈環(huán)狀產(chǎn)物，并將其命名為Target，序列從5'端到3'端劃分為3個(gè)區(qū)域（a、L*、b）。相應(yīng)地，發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針從5'端到3'端劃分為9個(gè)區(qū)域（3、o、n、1、m、L、m*、1*、n*），命名為Transducer。其中區(qū)域o和n合并為區(qū)域2；區(qū)域3，2和1合并構(gòu)成C1序列。區(qū)域L與Target的L*互補(bǔ)，是待測(cè)物識(shí)別位點(diǎn)。m是隨機(jī)加入的緩沖序列。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，預(yù)期歷程如圖2所示：Target的L*部分與Transducer的L部分雜交，強(qiáng)制性打開(kāi)Transducer的莖部，游離出C1的區(qū)域1。然而，反應(yīng)還可能存在如圖2所示的其它多種副反應(yīng)和非預(yù)期的情況，降低封閉效率或打開(kāi)效率。

3.4 LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)

經(jīng)上述優(yōu)化，利用Transducer 3對(duì)大腸桿菌基因組中麥芽糖/麥芽糊精轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白MALK合成基因（簡(jiǎn)稱malB）的LAMP產(chǎn)物進(jìn)行中轉(zhuǎn)和CHA檢測(cè)（LAMP引物和靈敏度參見(jiàn)文獻(xiàn)[31]）。如圖 6所示，當(dāng)LAMP模板濃度低至20拷貝時(shí)，仍可被CHA有效檢出，信噪比良好。但即使在大量LAMP產(chǎn)物存在下，CHA的檢測(cè)曲線也無(wú)法如圖5C（如5 nmol/L Target）所示在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)（平臺(tái)）。原因是在LAMP產(chǎn)物中，L*序列被限制在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，與Transducer為環(huán)對(duì)環(huán)雜交，這種情況下雜交效率會(huì)降低很多。

除熒光法之外，本研究還利用電化學(xué)方法對(duì)上述LAMP產(chǎn)物的傳導(dǎo)檢測(cè)體系進(jìn)行了驗(yàn)證。方法原理如圖7A所示，將H1的區(qū)域6去掉，并在其3'端修飾上亞甲基藍(lán)（MB）探針，稱作H1-MB。將巰基修飾的區(qū)域5*-2*序列（簡(jiǎn)稱HS-P探針）通過(guò)金-硫鍵固定于金電極表面，并用巰基己醇（MCH）進(jìn)行封閉，形成HS-P/MCH修飾電極。當(dāng)CHA反應(yīng)未發(fā)生前，H1-MB的3'端只有區(qū)域5游離，其只有8個(gè)堿基，并不能與HS-P的5*穩(wěn)定雜交。而當(dāng)LAMP產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Transducer 3中轉(zhuǎn)，并引發(fā)H1-MB和H2的CHA組裝后，H1釋放出游離的區(qū)域2，區(qū)域2和區(qū)域5組成的區(qū)域2～5長(zhǎng)達(dá)16個(gè)堿基，可與HS-P的區(qū)域5*-2*雜交成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而將MB探針帶至電極表面，引發(fā)可以檢測(cè)到的MB氧化還原電流。如圖7B所示，采用電化學(xué)方法，同樣達(dá)到了如熒光方法相近的信噪比，證明此中轉(zhuǎn)方法的普適性。

4 結(jié) 論

本研究提供了一套設(shè)計(jì)發(fā)卡型中轉(zhuǎn)探針的詳細(xì)規(guī)律和思路，使其能作為恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和下游CHA核酸分子線路間的有效橋梁，將基因序列信息準(zhǔn)確、特異地傳導(dǎo)至熒光和電化學(xué)信號(hào)。在這樣一個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增-中轉(zhuǎn)探針-CHA檢測(cè)構(gòu)成的檢測(cè)流程中，恒溫?cái)U(kuò)增是靈敏度的主要來(lái)源，中轉(zhuǎn)探針和CHA是特異性的主要來(lái)源，也是信號(hào)幅度的主要來(lái)源。而中轉(zhuǎn)探針的引入，也使得基于CHA的基因檢測(cè)更為方便，并更具普適性。針對(duì)不同的基因序列，僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單地設(shè)計(jì)一套中轉(zhuǎn)探針，即可將基因序列傳導(dǎo)至一套性能良好的CHA反應(yīng)，無(wú)需重新設(shè)計(jì)整個(gè)CHA反應(yīng)。中轉(zhuǎn)探針的設(shè)計(jì)方法并非僅限于發(fā)卡型一種，本課題組也報(bào)道過(guò)三通、四通結(jié)構(gòu)的中轉(zhuǎn)方法[31～33]。這些不同的中轉(zhuǎn)方法各具優(yōu)勢(shì)，可以全面滿足各種類型的檢測(cè)需求，充分顯現(xiàn)出核酸分子線路在實(shí)際應(yīng)用中的巨大潛力和廣闊前景。

References

1 Liu D Y， Daubendiek S L， Zillman M A， Ryan K， Kool E T. J. Am. Chem. Soc.， 1996， 118（7）： 1587-1594

2 Guatelli J C， Whitfield K M， Kwoh D Y， Barringer K J， Richman D D， Gingeras T R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87（5）： 1874-1878

3 Compton J.Nature， 1991， 350（6313）： 91-92

4 Walker G T， Fraiser M S， Schram J L， Little M C， Nadeau J G， Malinowski D P. Nucleic Acids Res.， 1992， 20（7）： 1691-1696

5 Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， Yonekawa T， Watanabe K， Amino N， Hase T. Nucleic Acids Res.， 2000， 28（12）： e63

6 Vincent M， Xu Y， Kong H M. EMBO Rep.， 2004， 5（8）： 795-800

7 Piepenburg O， Williams C H， Stemple D L， Armes N A. PLOS Biol.， 2006， 4（7）： e204

8 Craw P， Balachandran W. Lab Chip， 2012， 12（14）： 2469-2486

9 Gill P， Ghaemi A. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids， 2008， 27（3）： 224-243

10 Zhang X Z， Lowe S B， Gooding J J. Biosens. Bioelectron.， 2014， 61： 491-499

11 Li J， Macdonald J. Biosens. Bioelectron.， 2015， 64： 196-211

12 Li B L， Chen X， Ellington A D. Anal. Chem.， 2012， 84（19）： 8371-8377

13 Zhao Y X， Chen F， Li Q， Wang L H， Fan C H. Chem. Rev.， 2015， 115（22）： 12491-12545

14 Stojanovic M N， Stefanovic D， Rudchenko S. Acc. Chem. Res.， 2014， 47（6）： 1845-1852

15 Wang F A， Lu C H， Willner I. Chem. Rev.， 2014， 114（5）： 2881-2941

16 Jung C， Ellington A D. Acc. Chem. Res.， 2014， 47（6）： 1825-1835

17 Bi S， Yue S Z， Zhang S S. Chem. Soc. Rev.， 2017， 46（14）： 4281-4298

18 Qu X M， Zhu D， Yao G B， Su S， Chao J， Liu H J， Zuo X L， Wang L H， Shi J Y， Wang L H， Huang W， Pei H， Fan C H. Angew. Chem. Int. Edit.， 2017， 56（7）： 1855-1858

19 Dirks R M， Pierce N A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2004， 101（43）： 15275-15278

20 Choi H M T， Chang J Y， Trinh L A， Padilla J E， Fraser S E， Pierce N A. Nat. Biotechnol.， 2010， 28（11）： 1208-1212

21 Zhang D Y， Turberfield A J， Yurke B， Winfree E. Science， 2007， 318（5853）： 1121-1125

22 Yin P， Choi H M T， Calvert C R， Pierce N A. Nature， 2008， 451（7176）： 318-322

23 Li B L， Ellington A D， Chen X. Nucleic Acids Res.， 2011， 39（16）： e110

24 Wu Z K， Fan H H， Satyavolu N S R， Wang W J， Lake R， Jiang J H， Lu Y. Angew. Chem. Int. Edit.， 2017， 56（30）： 8721-8725

25 Li F， Zhang H Q， Wang Z X， Li X K， Li X F， Le X C. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（7）： 2443-2446

26 Wu C C， Cansiz S， Zhang L Q， Teng I T， Qiu L P， Li J， Liu Y ， Zhou C S， Hu R， Zhang T， Cui C， Cui L， Tan W H. J. Am. Chem. Soc.， 2015， 137（15）： 4900-4903

27 Ma C P， Wang W S， Li Z X， Cao J J， Wang Q Y. Anal. Biochem.， 2012， 429（2）： 99-102

28 Jiang Y， Li B L， Milligan J N， Bhadra S， Ellington A D. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（20）： 7430-7433

29 Yang Z L， Liu Y C ， Lu W， Yuan Q P， Wang W， Pu Q S， Yao B. Talanta， 2016， 152： 301-307

30 Qu X M， Wang S P， Ge Z L， Wang J B， Yao G B， Li J， Zuo X L， Shi J Y， Song S P， Wang L H， Li L， Pei H， Fan C H. J. Am. Chem. Soc.， 2017， 139（30）： 10176-10179

31 Tang Y D， Lu B Y， Zhu Z T， Li B L. Chem. Sci.， 2018， 9（3）： 760-769

32 Li B L， Jiang Y， Chen X， Ellington A D. J. Am. Chem. Soc.， 2012， 134（34）： 13918-13921

33 Tang Y D， Zhu Z T， Lu B Y， Li B L. Chem. Commun.， 2016， 52（88）： 13043-13046

Abstract Isothermal nucleic acid amplifications， as powerful as polymerase chain reaction but functioning at a constant temperature， are considered to be very promising technique in achieving point-of-care gene diagnostics. However， until now， their practical applications are still seriously lagged by the bad reliability resulting from the problems such as false positive amplification and low signal amplitude. In this work， a universal transduction method in which any sequence （including loop-mediated isothermal amplification products） could be transduced via a hairpin transducer into a catalyst of a well-engineered circuit （catalytic hairpin assembly， CHA） was established. Because CHA circuit could amplify tens to hundreds fold with especially high sequence specificity， it could provide both accuracy and high amplitude for sequence detection. And for a new targeting sequence， the only sequence needed to be changed was the hairpin transducer. Due to the importance of the transducer， we provided and verified a universal designing rule-set to guarantee the transducing efficiency （signal to background ratio） of the transducer. Transducers designed following this rule set were then proved to be very efficient in detecting pathogen gene targets. As less as near single molecule （20 copies） of pathogen genes could be detected with significant fluorescent and electrochemical signals.

Keywords Isothermal amplification； Universal transduction； Hairpin transducer； Nucleic acid circuit； Catalytic hairpin assembly； Fluorescence； Electrochemistry.

（Received 24 January 2018； accepted 10 April 2018）