周碩 唐鵬 王赟姣 王亮 王德強
摘 要 納米孔技術(shù)作為一種新型的分析檢測方法,被廣泛應用于核酸測序、蛋白質(zhì)/多肽分析以及病毒、微生物等生物大分子和金屬離子的檢測。隨著人們對公共安全和食品藥品安全等問題的日益關(guān)注,對有毒物質(zhì)的檢測也提出了更高的要求。鑒于納米孔分析方法具有高靈敏度和高選擇性等優(yōu)點,很多研究團隊將其應用于有毒物質(zhì)的檢測,進行了很多的研究工作。本文針對近年來納米孔技術(shù)在有毒物質(zhì)檢測中的應用進行綜述,并對其應用前景進行了展望。
關(guān)鍵詞 納米孔技術(shù);單分子檢測;有毒物質(zhì);靈敏度;選擇性;評述
1 引 言
納米孔分析方法是一種基于電脈沖技術(shù)的新型分析檢測技術(shù),通過分析一定電壓下分析物分子穿過納米孔道產(chǎn)生的阻塞電流信號實現(xiàn)對分析物的檢測[1]。不同的分析物通過納米孔時所產(chǎn)生的阻塞電流信號將表現(xiàn)出不同的信號特征(幅值,持續(xù)時間等)。而當納米級孔道的孔徑大小在1~30 nm范圍內(nèi)時,每次只能容許一個分子通過,因此,產(chǎn)生的阻塞電流信號的特征與過孔分子的構(gòu)象、大小、長度、電荷等固有屬性一一對應。通過分析這些過孔電流信號特征,就可以揭示分析物的結(jié)構(gòu)和組成等重要信息,從而實現(xiàn)對待測物的定性與定量的超靈敏檢測。目前,納米孔技術(shù)主要應用于兩大領(lǐng)域,即測序領(lǐng)域和非測序的單分子分析檢測領(lǐng)域。前者主要包括DNA測序[2~10]和蛋白質(zhì)測序[11~14],已有多篇綜述報道[15~20];后者則包括各種非測序的單分子鑒定方面的應用,如多肽的二級結(jié)構(gòu)鑒定[21~26]以及蛋白和適配體等其它單分子構(gòu)象研究[27-28],以及作為新型生物傳感器分析方法的應用,如核苷酸鏈中單個堿基差異的識別[29,30]、癌癥標記物的檢測[31]、藥物篩選[32~34]、金屬離子檢測[35~38]等,Yang等[39]曾針對納米孔技術(shù)在非基因測序方面的應用做過詳細介紹。
迄今為止,納米孔技術(shù)僅有20余年的發(fā)展歷史,但已在疾病診斷[40~44]、食品安全[45,46]、環(huán)境監(jiān)測[47~49]和公共安全[50~55]等領(lǐng)域取得了一系列突破性進展。隨著近年來公眾對公共安全和食品藥品安全的要求日益提高,研究者就如何利用納米孔實現(xiàn)對有毒物質(zhì)的快速高效檢測做了很多工作。本文將對近年來納米孔技術(shù)在有毒物質(zhì)檢測中的應用進行綜述,以期為未來納米孔商業(yè)化產(chǎn)品在公共安全、藥品安全及毒品檢查等方面的應用推廣提供技術(shù)參考。
2 納米孔技術(shù)在公共安全中的應用
2.1 神經(jīng)毒劑的檢測
神經(jīng)毒劑是一類以神經(jīng)組織為靶標的有毒物質(zhì),對人體神經(jīng)系統(tǒng)具有巨大的破壞力,常被用于殺傷性化學武器研制。目前, 主流的神經(jīng)毒劑檢測方法(如高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等)靈敏度較高,但需復雜的檢測儀器,因此無法實現(xiàn)神經(jīng)毒劑的現(xiàn)場快速檢測。Wang等[56]利用納米孔技術(shù)快速、簡便的優(yōu)勢,設計了一種鑒定神經(jīng)毒劑索曼和環(huán)沙林的新方法。 這種方法借助神經(jīng)毒劑易水解的特性,通過對其水解產(chǎn)物與修飾納米孔相互作用產(chǎn)生的電流信號的觀測,間接對神經(jīng)毒劑進行定性與定量的分析。神經(jīng)毒劑索曼和環(huán)沙林的主要水解產(chǎn)物通常以小分子CMPA(Cyclohexyl methylphosphonic acid)和PMPA(Pinacolyl methylphosphonate)形式存在,它們通過納米孔時不易產(chǎn)生阻塞電流信號。研究者以β環(huán)糊精(β-Cyclodextrin, β-CD)嵌入重組突變后的α-溶血素納米孔中,縮小納米孔孔徑,從而促使CMPA和PMPA在納米孔中與 β-CD發(fā)生相互作用,誘導阻塞電流變化,進而實現(xiàn)對索曼和環(huán)沙林的有效和靈敏的檢測。如圖1所示, β-CD(紅色)與α-溶血素納米孔結(jié)合后,會使納米孔阻塞而產(chǎn)生其特征阻塞電流;隨著在納米孔反應體系中加入CMPA和PMPA,它們會與 β-CD發(fā)生相互作用,從而在β-CD特征阻塞電流信號的基礎上產(chǎn)生新的電流信號。此外,由于CMPA和PMPA的結(jié)構(gòu)不同,二者產(chǎn)生的阻塞電流信號也不同,因此可以實現(xiàn)兩者的同時鑒定分析。這種方法對神經(jīng)毒劑索曼和環(huán)沙林水解產(chǎn)物CMPA和PMPA的檢出限分別可以達到0.02和0.01 mg/L。
nce of 40 μmol/L β-CD[56].
2.2 炭疽桿菌的檢測
炭疽毒素(Anthrax toxin)是一種由炭疽桿菌產(chǎn)生的致命毒素,分為水腫毒素和致死毒素,可引發(fā)一種人畜共患的急性傳染病,從而引起人畜各臟器和組織的出血性浸潤、水腫和壞死[57,58]。炭疽桿菌會形成“芽孢”,其生命力極其頑強,能抵抗各種殺滅手段,而且壽命極長,深埋、真空封存幾十年后仍然具有很強的感染能力[59,60]。雖然現(xiàn)在醫(yī)學診斷和藥物治療等技術(shù)取得了突飛猛進的發(fā)展,但是人類社會在面臨這種急性傳染病時,依然存在致命風險。以細胞培養(yǎng)、聚合酶鏈式反應、酶聯(lián)免疫反應為代表的傳統(tǒng)檢測手段,耗時長,且不適于現(xiàn)場的實時檢測環(huán)境,在危機爆發(fā)時,無法實現(xiàn)實時的現(xiàn)場快速診斷,因此迫切需要開發(fā)一種便捷有效的檢測方法,對炭疽桿菌進行分析和監(jiān)控。
2.2.1 炭疽致死毒素的檢測 Guan研究團隊針對炭疽的檢測,提出了一種實時、快速、無需標記的納米孔分析方法[50]。該方法以炭疽毒素的重要組成成分——炭疽致死毒素(Anthrax lethal factor,aLF)為研究對象,選擇致死毒素的特異性遺傳DNA片段為檢測樣本,通過分析DNA雙鏈雜化與解鏈在α-溶血素納米孔中產(chǎn)生的特異性電流變化,從而實現(xiàn)對炭疽致死毒素的有效檢測與鑒定(圖2)。他們的研究表明,單鏈DNA探針與炭疽特異性DNA片段(aLF)分別加入納米孔時,各自產(chǎn)生的阻塞電流無法區(qū)分,然而將二者的混合物加入納米孔體系后,由于堿基互補促使單鏈DNA探針與炭疽DNA雜化,雜化后的雙鏈DNA分子在通過納米孔時,在外加電壓和與納米孔相互作用的共同推動下,會誘發(fā)雙鏈分子的解鏈行為,進而生成一種完全不同的、可識別的電流信號,從而實現(xiàn)對炭疽致死毒素的檢測。該分析方法對炭疽致死毒素特異性DNA片段的檢測具有非常好的選擇性,可以區(qū)分單個堿基的突變。此方法在血清中的檢出限低于100 pmol/L。
2.2.2 炭疽孢子分泌物的納米孔分析 納米孔技術(shù)對炭疽的檢測,不僅可通過對其遺傳片段的分析實現(xiàn),也可通過對其孢子分泌物吡啶二羧酸(Dipicolinic acid,DPA)的分析進行, 可為炭疽感染的預防和控制提供更為有效的手段。但是,由于DPA分子太小,無法在納米孔中直接檢測。研究人員借鑒化學中經(jīng)典的反滴定法設計了一套全新的納米孔分析方法[51]。如圖3所示, Tb3+可以與配體二乙烯三胺五亞甲基膦酸(Diethylene triamine pentamethylphosphonic acid,DTPMPA)和DPA分別發(fā)生絡合反應,生成相應的絡合物,反應前后納米孔中可以產(chǎn)生不同類型的可識別的電流變化,但由于DPA與Tb3+絡合力更強,當檢測體系中存在DPA時,會導致電流信號由配體DTPMPA-Tb3+絡合物信號向配體DTPMPA信號的反向轉(zhuǎn)變,這種變化隨著DPA濃度的增加變得更為明顯。通過這種信號的反轉(zhuǎn),可以實現(xiàn)對炭疽芽孢分泌物的有效鑒定。雖然這種方法的靈敏度(34.6 nmol/L)比熒光檢測法(2 nmol/L)低[61],但該方法無需熒光標記,實驗操作更為簡單。此外,這也是首次將化學定量法中的反滴定法與納米孔技術(shù)相結(jié)合,為開拓新的分析檢測手段提供了全新思路。
2.3 肉毒素檢測
肉毒素(Bontulinum neurotoxin,BoNTs)是肉毒桿菌產(chǎn)生的分子神經(jīng)毒素,是已知毒素中毒性最強的生物毒素,致死量為1 ng/kg體重[62]。由于肉毒素可通過食物鏈傳播而危害人類安全,所以也被用作生化武器[63]。目前,在各種肉毒素種類(BoNTs A-G)中只有A、B、E和F對人類有毒害作用[64]。其毒害機理主要是抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿,引起肌肉松弛麻痹,特別是引起呼吸肌麻痹而致死?;瘜W結(jié)構(gòu)上,肉毒桿菌神經(jīng)毒素作為一種蛋白分為重鏈和輕鏈,兩者之間由二硫鍵連接。重鏈分子量為100 kDa, 可以對神經(jīng)系統(tǒng)造成破壞;輕鏈分子量為50 kDa,可以從囊泡穿過進入到細胞溶質(zhì)中,作為Zn2+誘導的肽鏈內(nèi)切酶特異性酶切SNARE蛋白復合體,從而妨礙胞吐作用和神經(jīng)傳遞素的釋放,進而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[65]。因此,無論是從生化防護還是醫(yī)療診斷角度來考慮,都需要對肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行早期、快速的檢測。
納米孔技術(shù)作為一種新型的超靈敏的快捷檢測手段已經(jīng)被成功應用于多肽和蛋白質(zhì)分析[66~70]。值得注意的是,納米孔可通過對酶切反應中水解多肽的分析實現(xiàn)對蛋白酶功能的研究[43,71,72]。以肉毒素B(BoNTs B)為例(圖4),在Zn2+存在條件下,肉毒素B可以酶切神經(jīng)細胞突出蛋白(Synaptic protein sb2,1-93),剪切位點位于76~77位氨基酸之間,生成N端Lp-sb2(1-76)和C端sb2(77-93)兩個片段,因此,通過對兩個蛋白片段的納米孔過孔信號進行分析,即可間接檢測肉毒素B[45]。實驗結(jié)果證實,以酶切后的sb2(77-93)作為生物標記物(Lp-sb2分子太大,不足以穿過納米孔產(chǎn)生特征電流信號),通過對其在納米孔中的過孔信號的分析,可以在幾分鐘內(nèi)檢測到低于500 pmol/L的有活性的肉毒素B,這種分析方法在血清樣本體系中效果良好。
3 納米孔技術(shù)在藥物安全與毒品檢測中的應用
3.1 可卡因檢測
可卡因在醫(yī)學中被用于局部麻醉藥;同時,可卡因又是一種強烈的天然中樞興奮劑,會導致吸食用者變得情緒高漲,且容易產(chǎn)生藥物依賴上癮,被各國政府列為主要違禁藥品之一[73]。常見的可卡因檢測方法主要包括電泳法、色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法等,這些方法操作繁瑣、成本高,無法進行現(xiàn)場實時檢測。Rauf 等[74]提出了一種基于α-溶血素納米孔的檢測方法,無需化學標記即可實現(xiàn)可卡因的快速、高靈敏分析,采用可卡因DNA適配體探針,該適配體由兩條堿基互補的DNA單鏈組成。當適配體通過α-溶血素納米孔時, 由于孔道最窄處直徑(~1.4 nm)小于雙鏈DNA適配體(~2.2 nm)的直徑,雙鏈DNA在外部電壓推動下,會與納米孔道發(fā)生相互作用而解鏈。這種解鏈行為會產(chǎn)生一種可識別的特異性電流信號。加入含有可卡因的樣品后,可卡因會與適配體中的單鏈A特異性結(jié)合,形成穩(wěn)定的Y型復合結(jié)構(gòu),釋放出單鏈B,提取單鏈B通過納米孔產(chǎn)生的特征電流信號,就可以實現(xiàn)對可卡因的檢測(圖5)。
此外,在0.05~100 μmol/L濃度范圍內(nèi),可卡因濃度與適配體B鏈產(chǎn)生的納米孔電流信號事件呈線性關(guān)系,因此可以通過檢測適配體B鏈產(chǎn)生的電流信號,推斷出與適配體特異性結(jié)合的可卡因的含量,從而定量檢測可卡因在樣品中的含量。該方法的檢測限可以低至50 nmol/L,且適用于復雜的生物體液樣本,例如在人類唾液和血清樣本中同樣具有高選擇性。其它研究團隊也對納米孔技術(shù)檢測可卡因進行過相關(guān)研究[75]。
3.2 四環(huán)素檢測
作為一種常見的抗生素,四環(huán)素(Tetracycline,Tet)在醫(yī)學中一直被廣泛應用于抑菌、殺菌及霍亂、梅毒、瘧疾、瘟疫等的感染治療[76,77]。但四環(huán)素會導致肝損傷、維生素缺乏等多種不良反應。此外,環(huán)境中的四環(huán)素殘留還會導致細菌產(chǎn)生耐藥性,進而威脅人類和動物的健康。目前常用的四環(huán)素檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法[78]、色譜法[79]等,這些傳統(tǒng)檢測方法具有較好的可靠性和穩(wěn)定性,但操作繁瑣、檢測周期長,無法滿足實時檢測分析的要求。
本研究組設計了一種用于四環(huán)素的快速鑒定的納米孔傳感器[33],選用厚度10 nm的Si3N4為襯底的固態(tài)孔,其直徑為8~9 nm。由于四環(huán)素可以促使rtTA蛋白和DNA單鏈(TRE)相互結(jié)合形成復合體,因此通過分析不同四環(huán)素濃度下的復合體特征電流信號,即可實現(xiàn)對四環(huán)素的檢測。如圖6所示,在不加入四環(huán)素時,rtTA蛋白和DNA單鏈(TRE)的混合物在納米孔中只會引起較小的阻塞電流變化;加入四環(huán)素后,rtTA蛋白與DNA單鏈(TRE)結(jié)合生成的復合體會大量形成,且其特征電流信號數(shù)目隨四環(huán)素加入量的增加而增大。采用該方法還可研究四環(huán)素與DNA和蛋白之間的相互作用。
3.3 煙草花葉病毒檢測
納米孔不僅可用于DNA、蛋白質(zhì)、多肽、有機磷化合物等生物化學分子的檢測,還可用于病毒的篩查[41,50]。Wu等[55]利用直徑為30 nm的固態(tài)孔,結(jié)合郎之萬動力學(Langevin dynamics),研究了煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)通過納米孔的動力學過程。煙草花葉病毒通常作用于植物,是煙草花葉病等的病原體,其長度為300 nm,直徑18 nm[80]。由圖7可知,TMV通過納米孔時會產(chǎn)生3種主要的電流阻塞信號。Type A是一種常見的矩形信號,類似DNA的過孔信號;而Type B和Type C信號的開端有不規(guī)則的波動,這是由于TMV在進孔前會與納米孔發(fā)生相互作用,從而產(chǎn)生預過孔信號。這項研究體現(xiàn)了納米孔在病毒檢測應用方面的潛力。
4 展 望
納米孔分析技術(shù)作為一種新的分析手段,具有操作簡便、快速、高靈敏、高特異性和高選擇性等優(yōu)勢。隨著以納米孔技術(shù)為核心的商業(yè)化產(chǎn)品的推出,該技術(shù)經(jīng)過不斷改進,在檢測靈敏度、分析物選擇特異性和便攜性等方面日趨穩(wěn)定,可以相信納米孔作為一種新興的單分子檢測技術(shù),未來將在測序領(lǐng)域和非測序的單分子檢測領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用。
但是,納米孔技術(shù)作為一種新型的納米傳感器用于實際應用和推廣,還需解決納米孔通量低的問題。另外,納米孔技術(shù)對未知檢測物的定性分析是目前納米孔技術(shù)所面臨的難題,如測序領(lǐng)域中對未知序列的測定和單分子檢測領(lǐng)域中對未知成分的鑒定等。通過將微納加工、單分子操控、計算機模擬和生物信息學等技術(shù)相結(jié)合,掌握分子動力學的理論研究方法,建立足夠的理論和研究模型,將有望解決上述難題。此外,將單分子熒光成像技術(shù)與納米孔電流信號相結(jié)合,實現(xiàn)光電聯(lián)合檢測分析,從瞬時電流調(diào)制信號和熒光信號中提取相關(guān)的動力學或物理參數(shù),更有助于揭示分析物在納米孔中的分子行為,為單分子檢測技術(shù)的發(fā)展提供更為有力的支持。
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Abstract As a novel analytical method, nanopore sensing is widely applied in many fields such as nucleic acids sequencing, protein/peptide analysis, detection of metal ions and biomacromolecules including virus, bacteria, etc. With the growing public concerns over dietary safety and public security, there has been a greater demand on the detection of toxic molecules. With its high sensitivity and selectivity, nanopore sensing is considered as a more powerful assay, which has been reported in many research articles. Accordingly, this paper surveys the application studies of nanopore sensing in detection of toxic molecules.
Keywords Nanopore technology; Single-molecule sensing; Toxic molecules; Sensitivity; Selectivity; Review
(Received 26 March 2018; accepted 8 May 2018)