染色體異常、染色體多態(tài)性與睪丸生精障礙的相關(guān)性分析

李秀蘭 莫小東 唐 莉 魏海云

1.東莞市人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心(廣東東莞 523000);2.東莞市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科(廣東東莞 523000)

前 言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道顯示,在適齡夫婦中有約15%的人群存在不育,其中超過50%是由男性因素導(dǎo)致[1]。 我國相關(guān)文獻(xiàn)顯示,適齡夫婦不育的發(fā)生率為10% ～20%,因其發(fā)病率逐年升高而受到廣大學(xué)者的密切關(guān)注[2]。 導(dǎo)致男性生殖系統(tǒng)功能障礙多為先天性發(fā)育異常,如睪丸發(fā)育不全等,后天因素生殖系統(tǒng)感染等等。 近些年,逐漸發(fā)現(xiàn)染色體異常是導(dǎo)致男性生殖功能障礙的主要原因,與正常男性相比,睪丸生精障礙的患者染色體異常主要表現(xiàn)為Y 染色體無精子因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失,且發(fā)生率明顯升高[3]。 相關(guān)研究顯示,少精子癥和無精子癥中發(fā)生染色體異常的概率分別為4.6%和13.7%,通常存在染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常,數(shù)目變化常表現(xiàn)為三體、三倍體及X 單體,結(jié)構(gòu)異常為染色體斷裂、倒置及缺失[4]。 隨著染色體顯帶技術(shù)發(fā)展,對(duì)染色體形態(tài)及結(jié)構(gòu)有了全新的認(rèn)知,一種涉及染色體結(jié)構(gòu)、寬窄及著色的微小恒定變異引起了人們的關(guān)注,被稱為染色體多態(tài)性[5]。 染色體多態(tài)性廣泛存在健康人群中,但是不會(huì)誘發(fā)疾病,屬于一種正常變異。 但越來越多的學(xué)者研究證實(shí),染色體多態(tài)性與生殖疾病存在關(guān)聯(lián),染色體多態(tài)性的男性精子非整倍概率增加,臨床通常診斷結(jié)果為少精子或無精子,患者存在生育障礙,但是觀點(diǎn)尚未得到統(tǒng)一,還需要進(jìn)一步研究[6]。 本文通過收集我院295 例睪丸生精障礙患者進(jìn)行染色體核型分析及性激素檢查來探討其相關(guān)性及影響。

一、資料與方法

(一)一般資料

收集2020 年4 月～2021 年5 月經(jīng)本院生殖醫(yī)學(xué)科診斷為睪丸生精障礙的295 例患者作為研究對(duì)象。 年齡23 歲～45 歲,平均年齡34 歲,少精子癥178 例,無精子癥為117 例。 納入患者均符合WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》診斷,包含患者至少連續(xù)進(jìn)行2 次以上的常規(guī)檢查,后經(jīng)離心均未發(fā)現(xiàn)精子為無精子癥,精子密度＜15×106/mL 為少精子癥。 所有患者均排除睪丸損傷、睪丸腫瘤以及其他因梗阻導(dǎo)致無精子癥等非睪丸生精障礙患者。

(二)染色體G 顯帶核型分析

所有患者采用5mL 無菌注射器,于肘部抽取1mL靜脈血,分別在2 個(gè)培養(yǎng)瓶中接種血液0.5mL,加入20μL ～40μL 的植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)液體,培養(yǎng)瓶瓶口采用酒精灼燒,輕輕搖晃放入培養(yǎng)箱,72h 后加入4μg/mL 的0.05mL 的秋水仙素,培養(yǎng)6h。 制備染色體標(biāo)本,終止培養(yǎng)后進(jìn)行離心沉淀,離棄上清液后加入7mL 的低滲液,1000r/min 離心6min,制備細(xì)胞懸液,滴在載玻片上后用口吹氣,后利用酒精燈烘烤,再室溫環(huán)境中存放3d 后可用來顯色。 染色體G 顯帶胰蛋白酶配制,25mL 的生理鹽水和25mL 的0.02% 的乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)導(dǎo)入立式染色缸內(nèi),加入2.5%胰蛋白酶1mL,滴入2 滴氫氧化鈉調(diào)整pH 值為7.0 ～7.2,后放到37℃水浴箱中預(yù)熱。 沖洗2 次,Giemsa 染色5 ～10min(37℃),過程中將G 顯帶染色體標(biāo)本鏡檢,核型3 ～5個(gè),異常者計(jì)數(shù)50 個(gè)細(xì)胞,分析10 個(gè)核型。

(三)血清中性激素檢測

采集靜脈血2mL,3500r/min 分離10min 采用購自BECKMAN COULTER 化學(xué)發(fā)光法試劑盒,按照試劑盒說明書檢測血清中血清催乳素(Prolactin,PRL)(正常參考 值: 55. 97 ～278. 36mIU/mL)、 黃 體 生 成 素(luteinizing hormone, LH) (正常參考值: 1. 24 ～8.62mIU/mL)、 促 卵 泡 生 成 素( Follicle-stimulating hormone,FSH)(正常參考值:1.27 ～19.26mIU/mL)、睪酮(testosterone,T)(正常參考值:2.6 ～13.2nmol/L)。

(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料性激素采用(X±S)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示,組間比較行卡方檢驗(yàn)或費(fèi)舍爾精確經(jīng)驗(yàn),以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

(一)染色體核型異常的檢出率

本研究選入的睪丸生精障礙的295 例,染色體異常為75 例(21.13%),少精子癥178 例中染色體異常為35 例(19.66%),無精子癥為117 例,其中染色體異常為40 例(34.19%),比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.856,P=0.005)。 295例患者中染色體多態(tài)性為71 例(24.07%),少精子癥178例中染色體多態(tài)性為34 例(19.10%),無精子癥為117例其中染色體多態(tài)性為37 例(31.62%),比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=6.597,P=0.010),見圖1。

圖1 各組患者染色體異常及染色體多態(tài)性比較

(二)無精子癥及少精子癥患者的染色體核型異常分析

少精子癥患者的染色體核型異常主要表現(xiàn)為平衡易位為10 例(28. 57%),次要表現(xiàn)為臂間倒位6 例(17.14%),無精子癥患者的染色體核型異常主要表現(xiàn)為克氏征為主為28 例(70.00%),具體不育患者核型異常情況見表1。

表1 無精子癥及少精子癥患者的染色體核型異常分析

(三)無精子癥及少精子癥患者的染色體多態(tài)性分析

本文無精子癥及少精子癥患者的染色體多態(tài)性主要包含小Y 長臂次縊痕增加(qh+)、隨體多態(tài)性(ps+/ps-)、大Y、小Y 及9 號(hào)染色體倒位。 無精子癥中Y 染色體多態(tài)性包含46,XY,小Y 及46,XY,大Y 為25 例(67. 57%),少精子癥患者的占據(jù)25例(73.53%)。 無精子癥患者的小Y 長臂次縊痕增加4 例(10.81%)、少精子癥患者為2 例(5.88%),無精子癥患者隨體多態(tài)性為4 例(10. 81%),少精子癥患者為2 例(5.88%),無精子癥患者9 號(hào)染色體倒位為4 例(10. 81%),少精子癥患者為5 例(14.71%),見表2。

表2 無精子癥及少精子癥患者的染色體多態(tài)性分析

(四)無精子癥及少精子癥染色體核型異?；颊吲c血清性激素水平比較

與少精子癥相比,無精子癥患者染色體核型異常的血清中FSH、LH 升高,T 水平降低(P＜0.05),見表3。

表3 染色體核型異常與血清性激素水平比較

(五)無精子癥及少精子癥染色體多態(tài)性與血清性激素水平比較

與少精子癥染色體多態(tài)性患者相比,無精子癥合并染色體多態(tài)性的患者血清中FSH、LH 升高,T 水平降低(P＜0.05),見表4。

表4 染色體多態(tài)性與血清性激素水平比較

三、討論

當(dāng)前,男性生育功能障礙顯著提高,約有30%的男性患者存在不育,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。 目前已知引起男性睪丸生精障礙的因素較多,其中染色體異常是導(dǎo)致男性不育的主要原因。 相關(guān)國內(nèi)報(bào)道數(shù)據(jù)證實(shí)我國不育男性41.70%的患者存在染色體異常[7]。 在男性生精障礙患者存在染色體核型異常及染色體多態(tài)性異常,目前,采用ICSI 技術(shù)雖然能夠改變個(gè)別無精子患者不育的結(jié)局,但是對(duì)子代存在高遺傳性的風(fēng)險(xiǎn),因此提高染色體異常檢出對(duì)于提高患者生育能力有重要作用。 本文通過觀察對(duì)睪丸生精障礙的患者進(jìn)行染色體核型分析,了解是否存在染色體異?；蛘呷旧w多態(tài)性,希望有助提高臨床治療針對(duì)性而增加臨床療效。

本文研究證實(shí),在295 例睪丸生精障礙的患者中無精子癥有34.19%患者存在染色體異常,少精子癥患者有19.66%患者存在染色體異常。 無精子癥患者染色體異常主要以克氏征為主,少精子癥染色體異常主要以平衡易位及臂間倒位為主[8]。 劉興章等[9]研究表示,在299 例睪丸生精障礙患者中無精子癥患者中染色體核型異常的概率為34. 50%,少精子癥中概率為13.00%,均說明染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致男性患者不育,本文結(jié)果與之相似。 無精子癥染色體核型異常主要表現(xiàn)在47,XXY 即克氏征,是由染色體數(shù)目異常導(dǎo)致是導(dǎo)致患者原發(fā)性睪丸功能障礙的主要原因[10]。該類患者臨床癥狀主要表現(xiàn)在睪丸小而硬,組織學(xué)上表現(xiàn)為睪丸曲細(xì)精管纖維化和透明樣變,管腔閉塞而無精子生成,是導(dǎo)致無精子癥主要原因[11]。 少精子癥患者染色體異常主要以染色體相互異位為主,可誘發(fā)精子改變程度與配子染色體產(chǎn)生重復(fù)或缺失。 染色體核型臂間倒位在少精子癥患者中檢出率較高,主要由染色體倒位形成,產(chǎn)生不成熟的精子而導(dǎo)致精子減少。

染色體多態(tài)性主要是指染色體微小形態(tài)的改變,人類染色體多態(tài)性主要集中在Y 染色體長臂遠(yuǎn)端、隨體及次縊痕等[12]。 Y 染色體形態(tài)改變主要表現(xiàn)為大Y及小Y 改變。 大Y 改變會(huì)導(dǎo)致Y 染色體中基因片段重疊性升高,導(dǎo)致有絲分裂增加,影響精子細(xì)胞分化及發(fā)育。 小Y 改變主要表示Y 染色體中遺傳物質(zhì)缺失。 以往多數(shù)研究表示,睪丸生殖功能障礙中患者中Y 染色體缺失可導(dǎo)致無精子或少精子[13-14]。 小Y 缺失可控制精子發(fā)育基因而影響睪丸發(fā)育而導(dǎo)致無精子或少精子。 朱紅芬[15]研究顯示,無精子癥患者中46,XY(大Y)染色體數(shù)目正常,但是Yq12 增長是長臂次縊痕增加所致,可導(dǎo)致精子細(xì)胞異常或死亡,誘發(fā)無精子癥產(chǎn)生,Y 染色體攜帶者生成異常精子的原因可能是:大Y染色體長臂遠(yuǎn)端的異染色質(zhì)主要是串聯(lián)重復(fù)序列,造成有絲分裂錯(cuò)誤,使基因調(diào)節(jié)及細(xì)胞分化的過程紊亂,從而直接影響男性生殖細(xì)胞的形成。 9 號(hào)染色體倒位在睪丸生精障礙患者中發(fā)病率較低,該類患者無遺傳物質(zhì)丟失,但是可導(dǎo)致精子生成基因順序顛倒,影響精子生成。 本文研究證實(shí),在無精子癥患者中有31.62%患者染色體多態(tài)性。 少精子癥患者中有19.10%患者存在染色體多態(tài)性。 無精子癥及少精子癥患者均表現(xiàn)為Y 染色體多態(tài)性,分別占67.57%及73.53%,還表現(xiàn)為小Y 長臂次縊痕、隨體多態(tài)性及9 號(hào)染色體倒位等。這與Li 等[16]研究結(jié)果相似。

正常情況下細(xì)胞分泌抑制素能夠降低FSH 釋放而維持正常水平,但是當(dāng)細(xì)胞-曲細(xì)精管復(fù)合體損傷時(shí)會(huì)降低抑制素水平,導(dǎo)致FSH 水平升高,LH 受到刺激或可調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中T 表達(dá)[17]。 胡皓睿[18]研究表示,睪丸功能性問題的主要原因是支持細(xì)胞-曲細(xì)精管復(fù)合受損,負(fù)反饋?zhàn)饔孟乱餏SH、LH 分泌的增加,隨即抑制睪酮T 的分泌,進(jìn)而直接影響患者生育能力,因此通過檢測血清中性激素水平有利于了解患者睪丸功能,為臨床治療提供依據(jù)。 睪丸生精障礙患者病變部位主要在睪丸,這時(shí)細(xì)胞-曲細(xì)精管復(fù)合體存在損傷而導(dǎo)致性激素水平改變,會(huì)進(jìn)一步影響精子密度[19]。 本文研究表示,與少精子癥患者相比,無精子癥患者FSH、LH 升高,T 水平降低,說明無精子癥患者的細(xì)胞-曲細(xì)精管復(fù)合體損傷加重可影響精子產(chǎn)生,甚至無精子產(chǎn)生。 47,XXY是中X 染色體增加會(huì)對(duì)睪丸產(chǎn)生影響,多余的X 染色體抑制了Y 染色體的正常功能,導(dǎo)致性征發(fā)育不良及曲細(xì)精管玻璃樣變性,間質(zhì)細(xì)胞增生,無精子生成而不育[20]。 本文研究表示,與少精子癥染色體多態(tài)性患者相比,在無精子癥染色體多態(tài)性異常患者中的FSH、LH 升高,T 水平降低,這與林靜[21]結(jié)果相似。 與少精子癥相比,無精子癥患者中Y染色體多態(tài)性表現(xiàn)為Y 染色體多態(tài)性表現(xiàn)為患者血清中呈現(xiàn)高水平的FSH,LH 表達(dá),T 表達(dá)降低,推測無精癥患者血清FSH、LH 的升高時(shí)極有可能出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常及Y 染色體片段改變,建議進(jìn)行外周血染色體的檢查。

綜上所述:男性睪丸生精障礙患者存在染色體異常概率明顯高于正常男性,其中核型異常以克氏征(47,XXY)較常見,與無精子癥患者相比,少精子癥患者血清中FSH、LH 降低,T 較高,可作為檢測男性患者睪丸生精障礙指標(biāo)并與染色體異常相關(guān),具體機(jī)制值得深入研究。