利用味精廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-聚谷氨酸及初步表征

張彥麗

山東行政學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014

味精廢水是生產(chǎn)味精時(shí)由谷氨酸發(fā)酵液提取谷氨酸后產(chǎn)生的廢液，以及生產(chǎn)過程中的洗滌廢水。它是一種高濃度有機(jī)廢水，具有酸性強(qiáng)、高COD、高 BOD、高硫酸根、高菌體含量和低溫等特點(diǎn)，處理難度很大，處理成本較高。味精廢水的治理已經(jīng)成為制約味精生產(chǎn)企業(yè)發(fā)展的重大難題（于信令，1995；喻軼等，2017）。味精廢水中含有大量的 L-谷氨酸、還原糖與氨氮，如果任其排放不僅會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且浪費(fèi)了寶貴資源。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid；γ-PGA）是一種通過微生物合成的均聚氨基酸化合物，具有生物可降解性、生物相容性、可食用、對(duì)人體和環(huán)境無毒害等優(yōu)點(diǎn)。因此，γ-聚谷氨酸被廣泛應(yīng)用于藥物工業(yè)、食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、生物材料及污水處理中，是一種應(yīng)用前景廣泛的高分子材料（Shih et al.，2001；王衛(wèi)國(guó)等，2016；彭偉等，2017）。γ-PGA的生產(chǎn)方法包括：化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、提取法和微生物發(fā)酵法（孫先林等，2012）。自1942年Bovarnick（1942）發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能夠在培養(yǎng)基中積累γ-PGA以來，對(duì)于利用微生物法合成γ-PGA的研究就十分活躍。γ-PGA生產(chǎn)菌株主要是芽孢桿菌屬（張宸，2018），包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）（Goto et al.，1992；Kubotah et al.，1993；Ogawa et al.，1997；Yoshihito et al.，1996）、炭疽芽孢桿菌（B. anthracis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）（Cromwick et al.，1995）和解淀粉芽孢桿菌（B. anmloliquefaciens）（邵麗等，2007）。與化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和提取法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA具有培養(yǎng)條件溫和、生產(chǎn)過程容易控制、γ-PGA分子量適宜、提取率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者和專家關(guān)注和研究的熱點(diǎn)，是當(dāng)前具有工業(yè)化前景的γ-PGA生產(chǎn)方法，但由于微生物的γ-PGA合成代謝途徑較為復(fù)雜，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基通過微生物法合成 γ-聚谷氨酸成本較高，制約了其大規(guī)模生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用。

本研究從降低γ-聚谷氨酸生產(chǎn)成本和實(shí)現(xiàn)味精廢水綜合利用的角度出發(fā)，以味精廢水為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌合成γ-聚谷氨酸，考察味精廢水濃度、發(fā)酵培養(yǎng)初始 pH、枯草芽孢桿菌接種量和發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和 γ-PGA產(chǎn)量的影響；以提高γ-PGA產(chǎn)量為目標(biāo)，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken模型設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，擬合二次回歸模型，優(yōu)化培養(yǎng)條件；測(cè)定粗產(chǎn)品中γ-PGA的含量，通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振對(duì)發(fā)酵合成的γ-PGA粗品進(jìn)行分析表征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

味精廢水取自山東省某味精生產(chǎn)企業(yè)，為高濃度的谷氨酸發(fā)酵廢液，廢水水質(zhì)指標(biāo)參照《水與廢水分析監(jiān)測(cè)方法》（第4版）測(cè)定，結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)試劑有常用的水質(zhì)分析化學(xué)試劑、生化試劑和茚三酮、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、氯仿（三氯甲烷）等。

表1 味精廢水水質(zhì)特征Table1 Characteristics of the monosodium glutamate wastewater

1.2 菌種活化及種子培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis-168），山東大學(xué)環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室冷凍保藏（-70 ℃），由山東大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院李力教授惠贈(zèng)。冷凍的枯草芽孢桿菌從-70 ℃依次轉(zhuǎn)移至-20 ℃、4 ℃進(jìn)行活化，平板劃線后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。平板培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基。從平板上取1～2環(huán)枯草牙孢桿菌接入種子培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶的裝液量為30 mL，在37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h。所有培養(yǎng)基均經(jīng)濕熱高壓滅菌后使用，滅菌條件：121 ℃，0.1 MPa，20 min。

1.3 以味精廢水為培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將微生物種子液按 3%～16%（V/V）的接種量接入1～10倍稀釋的味精廢水發(fā)酵培養(yǎng)基中，300 mL三角瓶中味精廢水的裝液量為50 mL，在37 ℃、180 r·min-1的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間。

1.4 生物量的測(cè)定

發(fā)酵菌懸液的生物量可用其在特定波長(zhǎng)處的吸光度（OD）來表示。將發(fā)酵液稀釋后用紫外-可見分光光度計(jì)（PGENERAL TU1810，China）于660 nm讀取菌懸液的OD660nm。

取 20 mL發(fā)酵液于已預(yù)先稱重的干燥離心管中，10000 r·min-1離心 10 min，上清液用于γ-PGA的分離提純，菌體用超純水洗滌3次，于80 ℃烘箱中烘至恒重，總質(zhì)量減去空管質(zhì)量即為菌體凈干重（Shi et al.，2006）。

1.5 γ-PGA的分離提取

將發(fā)酵液進(jìn)行高速離心（10000 r·min-1，10 min）除菌，取2 mL上清液于預(yù)先稱重離心管（10 mL）中，加入8 mL無水乙醇沉淀出產(chǎn)物，將含產(chǎn)物的離心管反復(fù)烘干至恒質(zhì)量，減去離心管的質(zhì)量即得到粗產(chǎn)品干質(zhì)量（g·L-1）。

1.6 γ-PGA含量的測(cè)定

在一定的pH條件下氨基酸與茚三酮共熱可生成藍(lán)紫色化合物，其顏色的深淺與氨基酸含量有關(guān)，可用于比色定量，因此可采用茚三酮比色法來測(cè)定谷氨酸的含量（Wang et al.，2005）。

1.7 γ-PGA的紫外光譜、紅外光譜和核磁共振表征

用紫外-可見分光光度計(jì)（PGENERAL TU1810，China）在190～600 nm范圍內(nèi)掃描經(jīng)去離子水溶解的γ-PGA粗產(chǎn)品溶液。

由乙醇沉淀法提取得到的微生物絮凝劑γ-PGA經(jīng)干燥處理后，進(jìn)行傅立葉紅外光譜和核磁共振分析。將2 mg微生物絮凝劑樣品與200 mg純KBr研細(xì)混勻，置于模具中，壓成透明薄片（樣品和KBr都要進(jìn)行干燥處理，且研磨粒度須小于2 μm，以避免散射光的影響）。用紅外光譜儀（Nicolet Avatar 370，US）在室溫下對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，并設(shè)定分辨率為2 cm-1，掃描范圍為4000～400 cm-1。采用核磁共振波譜儀（Bruker Av-300，Switzerland）分析γ-PGA的結(jié)構(gòu)，以D2O為溶劑溶解樣品，在測(cè)定溫度為300 K、脈沖寬度為13.8 μs、延遲時(shí)間為2 s和掃描次數(shù)為8的條件下采集試樣氫譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)單因素實(shí)驗(yàn)

微生物在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況與培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)條件密切相關(guān)。目前有關(guān)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌生產(chǎn) γ-PGA的培養(yǎng)條件研究較為成熟，一般控制溫度為 37 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為 180 r·min-1時(shí)有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和 γ-PGA 產(chǎn)量的提高。以味精廢水代替標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌 168，采用單因素控制實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究味精廢水濃度、培養(yǎng)初始 pH、接種量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量（以粗產(chǎn)品干重表示）的影響。在研究其中一個(gè)因素對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響時(shí)，其他3個(gè)因素的條件參考正交預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

2.1.1 味精廢水濃度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)及γ-PGA產(chǎn)量的影響

實(shí)驗(yàn)中固定味精廢水初始 pH為 6.0，接種量10 mL，在 37 ℃、180 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng) 48 h，將味精廢水稀釋至一定倍數(shù)，通過單因素控制實(shí)驗(yàn)考察稀釋倍數(shù)（1-不稀釋、2、4、6、8、10）對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況（以生物量和上清液特征吸光度表示）和γ-PGA產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(a)所示。

味精廢水的濃度對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和γ-PGA的產(chǎn)量均有較大影響。在低濃度的味精廢水中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度不足是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的主要因素；但是味精廢水的濃度過高（原水經(jīng)不稀釋）時(shí)，較高的SO42-濃度會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)（Wang et al.，2004），不利于γ-PGA的生物合成。在廢水處理的厭氧消化系統(tǒng)中，當(dāng) SO42-濃度為4000 mg·L-1時(shí)，會(huì)對(duì)厭氧系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用（Wang et al.，1995）。本實(shí)驗(yàn)中，味精廢水的SO42-濃度為15.26 g·L-1（表1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在好氧發(fā)酵的情況下，如果不經(jīng)稀釋，SO42-對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)和 γ-PGA產(chǎn)量產(chǎn)生較大抑制作用。當(dāng)味精廢水稀釋2倍時(shí)，發(fā)酵液的生物量達(dá)到最高值，但是γ-PGA的產(chǎn)量卻未達(dá)到最高值，而是在4倍稀釋的味精廢水中（SO42-濃度低于4000 mg·L-1）γ-PGA具有最高產(chǎn)量，顯示了γ-PGA的合成與枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)不同步，在較高的生物量情況下并未對(duì)應(yīng)最高的 γ-PGA產(chǎn)量，說明過高的SO42-濃度對(duì)γ-PGA合成過程抑制作用較強(qiáng)。

2.1.2 味精廢水初始pH對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)及γ-PGA產(chǎn)量的影響

圖1 （a）味精廢水濃度、（b）培養(yǎng)基初始pH、（c）接種量、（d）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液生物量Biomass、上清液特征吸光度OD660 nm和γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of (a) initial MSGW concentration, (b) initial culture pH, (c) inoculation concentration, (d) cultivation time on biomass, OD 660 nm,and γ-PGA production

調(diào)節(jié)味精廢水（4倍稀釋）初始的pH值分別為3.0～8.0，接種10 mL枯草芽孢桿菌，在37 ℃、180 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h，以考察pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(b)所示。培養(yǎng)基初始pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)和γ-PGA的生物合成具有很大的影響，過低和過高的初始pH均不利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和γ-PGA的積累。此外，在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，pH是逐漸升高的，以初始pH=6.0為例，在開始培養(yǎng)6、24和48 h后，發(fā)酵液的pH分別為6.3、7.2和7.9。所以，相對(duì)較低的初始pH（pH=6）有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和γ-PGA的合成。

2.1.3 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)及γ-PGA產(chǎn)量的影響

考慮到采用高濃度的味精廢水作為培養(yǎng)基，本著工藝簡(jiǎn)單、高效利用味精廢水的原則，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中枯草芽孢桿菌接種量取較高水平 4～14 mL，即7%～21%（V/V）。其他培養(yǎng)條件為：味精廢水 4倍稀釋，培養(yǎng)初始pH=6，在37 ℃、180 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(c)所示。由圖可知，當(dāng)枯草芽孢桿菌接種量為4～10 mL時(shí)，發(fā)酵液生物量和上清液特征吸光度OD660nm均隨接種量的增加而增大，當(dāng)接種量大于10 mL時(shí)趨于穩(wěn)定。而γ-PGA產(chǎn)量隨著接種量的增加先增大（接種量4～10 mL）而后出現(xiàn)下降趨勢(shì)（10～14 mL），并在接種量為 10 mL 時(shí)達(dá)到最大值(49.33±1.21) g·L-1。

在低接種量的情況下，味精廢水培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)豐富，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌菌體迅猛生長(zhǎng)，影響到γ-PGA的合成、積累。而當(dāng)接種量過高時(shí)，又會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)相對(duì)不足，枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)消耗較多營(yíng)養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后期菌體處于饑餓狀態(tài)，從而也影響到γ-PGA的合成與積累。所以，就4倍稀釋味精廢水而言，適度的接種量（10 mL）有利于菌體生長(zhǎng)和γ-PGA的積累。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)及γ-PGA產(chǎn)量的影響

微生物的生長(zhǎng)和γ-PGA的產(chǎn)量還受到培養(yǎng)時(shí)間的影響，調(diào)節(jié)4倍稀釋味精廢水的初始pH為6.0，接種量為10 mL，在37 ℃、180 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，繪制枯草芽孢桿菌的發(fā)酵進(jìn)程曲線（圖1(d)），以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

由圖1(d)可知，培養(yǎng)時(shí)間-γ-PGA的產(chǎn)量曲線可分為以下3個(gè)階段：第1階段為0～18 h，γ-PGA的產(chǎn)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加，這是由于發(fā)酵培養(yǎng)初期微生物需要一段時(shí)間適應(yīng)、菌體增殖。第2階段為 18～48 h，此時(shí)發(fā)酵液中已生長(zhǎng)增殖了一定量的菌體，γ-PGA的產(chǎn)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而大幅增加，為快速增長(zhǎng)階段。第3階段為48～72 h，此時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)不再明顯增長(zhǎng)，曲線趨于平緩。而發(fā)酵液生物量和上清液特征吸光度OD660nm的時(shí)間曲線的變化趨勢(shì)與γ-PGA產(chǎn)量的時(shí)間曲線相似，只是快速增長(zhǎng)階段有所提前（12～24 h）。顯然，當(dāng)以提高γ-PGA產(chǎn)量為目標(biāo)時(shí)，48 h是利用味精廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的適當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法（謝麗丹等，2017）。本實(shí)驗(yàn)采用 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理（Box et al.，1960），用 Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，建立二次回歸方程，并預(yù)測(cè)、驗(yàn)證枯草芽孢桿菌168菌株產(chǎn)γ-PGA的最佳培養(yǎng)條件。

2.2.1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以最大產(chǎn)量區(qū)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，以味精廢水稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)基初始pH和接種量3個(gè)因素為自變量，γ-PGA產(chǎn)率為響應(yīng)值，三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)中的因子與水平Table 2 Factors and level in BBD

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of BBD

2.2.2 二次回歸模型擬合及方差分析

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析和方差分析，結(jié)果如表 4、表 5所示。分別以A、B、C表示味精廢水稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)基初始 pH和接種量。擬合得到 γ-PGA產(chǎn)量 P（g·L-1）的回歸方程為：P=49.45+0.14X1-0.47X2+3.37X3+2.14X1X2-0.41X1X3-0.86X2X3-4.29X12-3.95X22-2.28X32。

表4 回歸模型及系數(shù)估計(jì)Table 4 Regression model and the coefficient estimates

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

從回歸方程和部分重復(fù)因子實(shí)驗(yàn)的回歸分析及方差分析結(jié)果（表 4、表 5）可以看出，回歸模型顯著性檢驗(yàn)的P值為0.0001，說明所得回歸方程的可信度較高，具有很好的代表性。此外由模型的可信度分析（表5）得到復(fù)相關(guān)系數(shù)r2=0.9909，校正后r2=0.9746，說明模型可以解釋99.09%實(shí)驗(yàn)所得的γ-PGA產(chǎn)量的變化，同時(shí)也說明該模型方程適用于本實(shí)驗(yàn)利用味精廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量的理論預(yù)測(cè)。另外，響應(yīng)值的變異系數(shù)CV較?。?.52），進(jìn)一步說明了該回歸模型的可信度較高。表5中，C、AB、BC、A2、B2和C2的P值小于 0.05，說明 C、AB、BC、A2、B2和 C2對(duì)響應(yīng)值都有極顯著的影響。

2.2.3 響應(yīng)面分析直觀圖

根據(jù)表3所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果和回歸方程，用Design-Expert 8.0.6軟件繪出味精廢水稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)初始pH和接種量3個(gè)因素中任意兩個(gè)因素對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖和等高線圖，結(jié)果分別見圖 2、圖 3、圖 4。每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。由響應(yīng)面和相應(yīng)的等高線圖可以看出，兩兩因素之間的相互作用都比較明顯。

2.2.4 γ-PGA產(chǎn)量預(yù)測(cè)及培養(yǎng)條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步確定γ-PGA最大產(chǎn)量的穩(wěn)定點(diǎn)，對(duì)2.2.2中得到的回歸方程求一階偏導(dǎo)并使其等于零，可求得回歸方程的極值點(diǎn)為：味精廢水稀釋倍數(shù)A=3.88，培養(yǎng)初始pH B=5.84，接種量C=10.55 mL；代入回歸方程解得預(yù)測(cè)的 γ-PGA產(chǎn)量為 54.78 g·L-1。以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后測(cè)得γ-PGA產(chǎn)量平均值為(53.51±0.92) g·L-1。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相差較小，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。通過優(yōu)化，使得γ-PGA產(chǎn)量較單因素實(shí)驗(yàn)產(chǎn)量(49.33±1.21)g·L-1提高了約 8.5%。

圖2 味精廢水稀釋倍數(shù)（A）與培養(yǎng)初始pH（B）對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖與等高線圖Fig. 2 Response surface plot and contour plot for the effects of Dilution fold of MSGW (A) and Initial culture pH (B) on γ-PGA production

圖3 味精廢水稀釋倍數(shù)（A）與接種量（C）對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖與等高線圖Fig. 3 Response surface plot and contour plot for the effects of Dilution fold of MSGW (A) and Inoculation volume (C) on γ-PGA production

圖4 培養(yǎng)初始pH（B）與接種量（C）對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖與等高線圖Fig. 4 Response surface plot and contour plot for the effects of Initial culture pH (B) and Inoculation volume (C) on γ-PGA production

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多株菌種曾被用于γ-PGA的生產(chǎn)，Ogawa et al.（1997）在40 ℃條件下培養(yǎng)地衣芽孢桿菌（B. licheniformis ATCC9945a）生產(chǎn)γ-PGA，其產(chǎn)量達(dá)到 35 g·L-1。Kubota et al.（2008）在 37 ℃條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌菌株B. subtilis F201生產(chǎn)γ-PGA，產(chǎn)量達(dá)到 50 g·L-1。Shi et al.（2006）對(duì)枯草芽孢桿菌菌株B. subtilis ZJU-7生產(chǎn)γ-PGA的培養(yǎng)基條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：蔗糖59.80 g·L-1，蛋白胨 53.54 g·L-1，L-谷氨酸 81.05 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，此時(shí)，γ-PGA 產(chǎn)量為 58 g·L-1（Shi et al.，2006）。本實(shí)驗(yàn)采用味精廢水作為枯草芽孢桿菌168的培養(yǎng)基，在3.88倍稀釋的味精廢水中，控制初始pH為5.84，以較高的菌種投加量（每50 mL味精廢水投加10.55 mL種子液），可以達(dá)到較高的γ-PGA產(chǎn)率，且不需另加碳源和氮源，具有降低生物法合成γ-PGA成本的潛力。所以，以味精廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌168生產(chǎn)γ-PGA是可行的，具有較大的開發(fā)潛力。

2.3 γ-PGA的含量及表征

2.3.1 γ-PGA含量的測(cè)定

采用茚三酮比色法測(cè)定γ-PGA粗產(chǎn)品的純度，結(jié)果如表6所示，以光密度D570為自變量、谷氨酸的質(zhì)量（y）為因變量求得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y=2007.5 D570-53.048，r2=0.9992

由表 6求得待測(cè)樣品的平均光密度為 0.650，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品水解液中谷氨酸的質(zhì)量為1251.83 μg，而測(cè)定的樣品水解液中樣品（γ-PGA粗產(chǎn)品）的質(zhì)量為1600 μg，所以γ-PGA粗產(chǎn)品中γ-PGA的含量為78.24%。

表6 各組溶液中谷氨酸含量及其在570 nm處的光密度Table 6 Glutamic acid content in the solutions and its optical density at 570 nm

2.3.2 γ-PGA紫外光譜掃描

γ-PGA粗產(chǎn)品溶液的紫外掃描光譜如圖 5所示：曲線為平滑曲線，且只出現(xiàn)一個(gè)峰，最大吸收波長(zhǎng)位于215 nm處，與γ-PGA 的特征紫外吸收波長(zhǎng)非常接近（216 nm）（Cromwick et al.，2015）。由于蛋白質(zhì)在280 nm有特征吸收峰，核酸在260 nm有特征吸收峰，而樣品在260～280 nm處沒有吸收峰，說明γ-PGA的聚合鍵與蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別。從谷氨酸氨基和羧基的特點(diǎn)說明γ-PGA是由γ-酰胺鍵聚合而成。

圖5 γ-PGA的紫外掃描圖譜Fig. 5 Ultra Violet scanning spectrum of γ-PGA

2.3.3 γ-PGA紅外光譜（FTIR）分析

聚谷氨酸中含有酰胺基、羧基和羰基等多種有機(jī)官能團(tuán)，具有很多特征吸收峰，采用紅外光譜法可以對(duì)γ-PGA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步的鑒定。由圖6可知，γ-PGA的紅外圖譜中存在4個(gè)酰胺吸收帶：3386.63 cm-1處存在一個(gè)寬大強(qiáng)吸收峰，該吸收峰為N—H對(duì)稱伸縮振動(dòng)帶（于曉丹，2011）（酰胺吸收帶I），由于分子間的締合作用使得該峰寬度比較大；1643.90 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為 C=O的伸縮振動(dòng)（酰胺吸收帶II）；1534.32 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是由N—H彎曲振動(dòng)和C—N平面搖擺振動(dòng)締合（酰胺吸收帶III）而成的；1125.93 cm-1處的吸收峰為C—N伸縮振動(dòng)（酰胺吸收帶IV）產(chǎn)生的，由這4個(gè)吸收峰結(jié)合證明該物質(zhì)中存在酰胺基。

圖6 γ-PGA的紅外光譜圖Fig. 6 Infrared spectra of γ-PGA

在 3100～2900 cm-1之間存在吸收峰 3068.42 cm-1和2932.55 cm-1，說明該化合物中存在飽和的C—H的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，即存在—CH2—基團(tuán)。1399.37 cm-1處的吸收峰是由—OH彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的，而1047.47 cm-1處的吸收峰則是由 C—O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，由這兩者結(jié)合上述1643.90 cm-1處的C=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，可以推測(cè)聚合物中含有—COOH基團(tuán)。而在低頻區(qū)1000～500 cm-1處的吸收峰則是由(CH2)n（n＞4）面外扭曲振動(dòng)和平面搖擺振動(dòng)產(chǎn)生的，由于N—H非平面彎曲振動(dòng)使其吸收峰增寬（于曉丹，2011）。通過上述的圖譜分析，可以發(fā)現(xiàn)聚合物中含有酰胺基、羧基和亞甲基，可以初步確定樣品中存在γ-PGA結(jié)構(gòu)。

2.3.4 γ-PGA核磁共振(NMR)分析

圖7 γ-PGA的1H NMR圖譜Fig. 7 1H NMR spectra of γ-PGA

圖7所示為γ-PGA樣品的1HNMR圖譜。樣品在化學(xué)位移0～10之間存在6個(gè)不同類型的質(zhì)子。根據(jù)質(zhì)子的化學(xué)位移范圍可以推測(cè) δ=7.989處為—NH特征峰，由于—NH、—OH等基團(tuán)的質(zhì)子氫較為活潑，在溶劑（D2O）中交換很快，并受測(cè)定條件（如溫度、濃度及溶劑等）的影響，化學(xué)位移值并不是一個(gè)固定的值，即使待測(cè)樣品用D2O溶液浸潤(rùn)后立即測(cè)定，由于質(zhì)子交換作用，—NH的質(zhì)子峰面積仍較小，且因氮原子與鄰近碳原子上的質(zhì)子的去耦合作用而呈現(xiàn)單吸收峰；—OH質(zhì)子的吸收峰消失；而δ=4.052處HDO的峰面積則較高?；瘜W(xué)位移δ=3.569處的質(zhì)子可推測(cè)為—CH結(jié)構(gòu)，而化學(xué)位移 δ=2.263處 2個(gè)質(zhì)子的單峰可推測(cè)為—CH2結(jié)構(gòu)，—CH質(zhì)子與—CH2發(fā)生質(zhì)子耦合而分裂成雙峰 δ=1.990和δ=1.885。此外根據(jù)質(zhì)子的化學(xué)位移范圍還可推測(cè)化學(xué)位移 δ=1.069處為—CONH結(jié)構(gòu)（于曉丹，2011）。經(jīng)過分析，1H NMR圖譜中各峰歸宿如表7所示。結(jié)合紅外分析結(jié)果，可以確定樣品中γ-PGA的結(jié)構(gòu)為（于曉丹，2011；萬紅貴等，2004）：

表7 γ-PGA樣品的1H NMR圖譜各峰歸宿Table7 Peak results of γ-PGA 1H NMR spectra

3 結(jié)論

（1）利用味精廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌 168產(chǎn)γ-PGA時(shí)，味精廢水濃度、初始pH、接種量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌168的生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量具有重要的影響。BBD響應(yīng)面正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：味精廢水稀釋倍數(shù) 3.88，培養(yǎng)初始pH 5.84，50 mL味精廢水接種量 10.55 mL，在37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng) 48 h，γ-PGA 的產(chǎn)量達(dá)到(53.51±0.92) g·L-1。利用味精廢水作為枯草芽孢桿菌 168的培養(yǎng)基，可以達(dá)到較高的 γ-PGA產(chǎn)率，且不需另加碳源和氮源，具有降低微生物發(fā)酵法合成γ-PGA的潛力。

（2）采用茚三酮比色法測(cè)定γ-PGA粗產(chǎn)品純度為78.24%。紫外掃描光譜顯示γ-PGA的聚合鍵與蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，γ-PGA是由γ-酰胺鍵聚合而成。傅立葉紅外光譜和核磁共振分析顯示樣品中含有酰胺基、羧基、羰基—CH、—CH2等基團(tuán)，可確定為γ-PGA的結(jié)構(gòu)。