鹽脅迫下12個甜蕎新品種生理特性及FtNHX1 基因表達(dá)差異的比較

張佳松，陸啟環(huán)，李發(fā)良，楊宏楹，徐 嬋，宋琎楠，王雅琦，楊洪兵

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東 青島 266109； 2.四川省涼山州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 高山作物研究站，四川 涼山 616150)

蕎麥又稱烏麥、甜蕎、花蕎、蕎子等，為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill.)一年生草本植物，籽粒呈三棱圓形，又叫三角米[1]；蕎麥在全球分布很廣，但主要集中在北半球，我國是蕎麥主要生產(chǎn)國之一，主要分布在山區(qū)，我國常見栽培品種有甜蕎麥(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.)2種，北部為甜蕎主產(chǎn)區(qū)，西南部為苦蕎主產(chǎn)區(qū)。蕎麥富含蛋白質(zhì)、脂肪及蘆丁、槲皮素、蕎醇等黃酮類物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[2-3]。蕎麥因含有豐富的黃酮類化合物而成為功能性食物，黃酮類化合物屬于多酚類，具有多種有益的生物學(xué)效應(yīng)，健康食品一直是人們的熱門話題，蕎麥種子作為功能食物已在世界各地廣泛應(yīng)用[4]。

土壤鹽漬化已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的主要非生物逆境因素之一，我國的鹽漬化土壤主要分布在平原地區(qū)，地下水資源較為豐富，具有較大的生產(chǎn)潛力和良好的開發(fā)價值[5]。鹽分過多會造成植物生理干旱、離子毒害和生理代謝紊亂等多種危害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來很大損失，人們通過物理化學(xué)和生物改良等綜合技術(shù)措施治理鹽漬土壤已經(jīng)刻不容緩[6]。

本研究以12個甜蕎新品種為試驗材料，鹽脅迫下通過測定種子發(fā)芽率、幼苗生理指標(biāo)及FtNHX1基因表達(dá)量來比較它們的耐鹽特性，旨在為蕎麥耐鹽品種篩選及有效利用鹽堿地資源提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

12個甜蕎新品種平蕎2號、定甜蕎3號、赤甜蕎1號、TQ11-3、T407-8、通蕎2號、云甜蕎1號、蒙0825、甜蕎1307-179、平選03-122、TQ11-6和赤甜蕎2號，由四川省涼山州西昌農(nóng)科所高山作物研究站提供。

1.2 種子發(fā)芽率測定

挑選籽粒飽滿、大小一致的甜蕎種子121粒，1 g/L高錳酸鉀消毒10 min，去離子水吸漲5 h，種子均勻擺放在鋪有濾紙培養(yǎng)皿中，NaCl脅迫濃度為100 mmol/L，26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天同一時間記錄發(fā)芽數(shù)，5 d后計算發(fā)芽率每個處理設(shè)3次重復(fù)。

發(fā)芽率(Gr)=n/N×100%，n為發(fā)芽數(shù)，N為種子總數(shù)。

1.3 幼苗生理指標(biāo)測定

甜蕎幼苗采用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，自然光照，晝夜溫度26 ℃/ 18 ℃，相對濕度60%左右，培養(yǎng)至兩葉一心期開始100 mmol/L NaCl脅迫處理，3 d后測定相關(guān)生理指標(biāo)。采用TTC法測定根系活力[7]；參照侯冬花[8]的方法測定質(zhì)膜透性；參照侯福林[9]的方法測定MDA含量；參照高樹濤等[10]的方法測定SOD活性。幼苗在NaCl脅迫處理前測定鮮質(zhì)量，處理5 d后再測一次鮮質(zhì)量，2次測定的差值即為鮮質(zhì)量增加量。每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4 RNA提取及FtNHX1表達(dá)量分析

提取高質(zhì)量RNA是對植物組織進(jìn)行分子水平研究的必要前提[11]，TRIzol是一種新型RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放的核酸酶，適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA[12]。取樣品0.1 g，按照TRIzol試劑盒步驟提取RNA，電泳檢測其質(zhì)量，分光光度計測定RNA濃度后，取等量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，參考蕎麥FtNHX1序列設(shè)計引物，引物序列見表1。采用熒光定量PCR儀(Agilent Technologes Stratagene Mx3000p)進(jìn)行實時熒光定量PCR，參照郭強(qiáng)等[13]的方法計算FtNHX1基因的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR所用引物Tab.1 The primers for Real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對12個甜蕎新品種種子發(fā)芽率的效應(yīng)

由圖1可知，鹽脅迫下，12個甜蕎新品種的種子發(fā)芽率均有不同程度的降低，其中,定甜蕎3號、赤甜蕎1號和甜蕎1307-179的種子發(fā)芽率降低幅度相對較大，分別比對照降低了36.44，37.10,30.45百分點，說明這3個品種的種子對鹽脅迫的耐受程度較低；TQ11-3、通蕎2號、云甜蕎1號、蒙0825和TQ11-6種子發(fā)芽率降低幅度較小，分別比對照降低了12.81，12.98，13.11，14.43,13.86百分點；而平蕎2號和T407-8種子發(fā)芽率與對照間無顯著差異，說明這2個品種的種子對鹽脅迫具有較高的耐受程度。

圖柱上不同字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。圖2-7同。 Values followed by Different letters are significantly Different at the 0.05 probability level. The same as Fig.2-7.

2.2 鹽脅迫對12個甜蕎新品種幼苗鮮質(zhì)量的效應(yīng)

由圖2可知，鹽脅迫對12個甜蕎新品種幼苗鮮質(zhì)量有明顯不同的影響，鹽脅迫下，平蕎2號、T407-8和云甜蕎1號幼苗鮮質(zhì)量呈顯著增加趨勢，分別比對照增加了48.91%，71.48%和28.98%，說明鹽分對這3個甜蕎品種的幼苗生長具有明顯促進(jìn)效應(yīng)，特別是對T407-8幼苗生長的促進(jìn)效應(yīng)更為突出；而定甜蕎3號、赤甜蕎1號和TQ11-6幼苗鮮質(zhì)量顯著降低，分別比對照降低了41.60%，47.49%和20.68%，其中，赤甜蕎1號降低幅度最大，說明鹽脅迫對赤甜蕎1號幼苗生長的抑制作用較大；其他6個甜蕎品種幼苗鮮質(zhì)量與對照無顯著差異，說明鹽脅迫對這6個甜蕎品種幼苗生長的影響較小。

圖2 鹽脅迫對12個甜蕎新品種幼苗鮮質(zhì)量的效應(yīng)Fig.2 Effect of salt stress on fresh weight of twelve new common buckwheat variety seedlings

2.3 鹽脅迫對12個甜蕎新品種幼苗根系活力的效應(yīng)

根系活力反映植物根系吸收與代謝能力強(qiáng)弱，是衡量根系功能的主要指標(biāo)之一，根系活力高低能直接影響植株抗逆性及地上部莖葉的生長和作物產(chǎn)量[14-15]。圖3顯示，與對照相比，鹽脅迫下，12個甜蕎新品種幼苗的根系活力均呈顯著降低趨勢，其中，定甜蕎3號、赤甜蕎1號、甜蕎1307-179和TQ11-6的幼苗根系活力降低幅度較大，分別比對照降低了46.67%，47.44%，30.02%和32.68%，特別是定甜蕎3號和赤甜蕎1號根系活力降低更為明顯；而平蕎2號、T407-8和云甜蕎1號根系活力降低幅度相對較小，分別比對照降低了15.50%，13.75%和14.52%，說明鹽脅迫對這3個甜蕎品種幼苗根系功能的影響較小。

2.4 鹽脅迫對12個甜蕎新品種葉片質(zhì)膜透性的效應(yīng)

電解質(zhì)外滲率是目前用于評價細(xì)胞膜透性的一種常用指標(biāo)，電解質(zhì)外滲率常用相對電導(dǎo)率表示，相對電導(dǎo)率與質(zhì)膜透性呈正相關(guān)[16-18]。由圖4可知，鹽脅迫下，12個甜蕎新品種葉片質(zhì)膜透性均有不同程度的增加，其中定甜蕎3號、赤甜蕎1號、TQ11-3、通蕎2號、蒙0825、甜蕎1307-179和赤甜蕎2號葉片質(zhì)膜透性顯著增加，分別比對照增加了46.04，63.19，36.29，25.48，41.78，42.43,38.10百分點，特別是赤甜蕎1號葉片質(zhì)膜透性增加幅度最大；而其他5個甜蕎品種葉片質(zhì)膜透性與對照無顯著差異，說明鹽脅迫對這5個甜蕎品種葉片細(xì)胞膜透性影響較小。

圖3 鹽脅迫對12個甜蕎新品種幼苗根系活力的效應(yīng)Fig.3 Effect of salt stress on roots vigors of twelve new common buckwheat variety seedlings

圖4 鹽脅迫對12個甜蕎新品種葉片質(zhì)膜透性的效應(yīng)Fig.4 Effect of salt stress on leaf plasmalemma permeability of twelve new common buckwheat varieties

2.5 鹽脅迫對12個甜蕎新品種葉片MDA含量的效應(yīng)

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低可以顯示植物受逆境傷害的程度[19]。如圖5所示，鹽脅迫下12個甜蕎新品種葉片MDA含量均顯著高于對照，其中，定甜蕎3號、赤甜蕎1號、甜蕎1307-179和TQ11-6增加幅度極大，分別比對照增加了554.85%，592.85%，424.46%和411.28%，說明鹽脅迫下這4個甜蕎品種葉片細(xì)胞膜脂過氧化程度較高；TQ11-3、蒙0825、平選03-122和赤甜蕎2號增加幅度也較大，分別比對照增加了323.34%，391.58%，383.47%和382.21%；而平蕎2號、T407-8、通蕎2號和云甜蕎1號增加幅度相對較小，分別比對照增加了222.12%，235.18%，267.69%和289.82%，說明鹽脅迫下這4個甜蕎品種葉片細(xì)胞膜脂過氧化程度相對較低。

圖5 鹽脅迫對12個甜蕎新品種葉片MDA含量的效應(yīng)Fig.5 Effect of salt stress on leaf MDA content of twelve new common buckwheat varieties

2.6 鹽脅迫對12個甜蕎新品種葉片SOD活性的效應(yīng)

SOD是一種普遍存在于動植物體內(nèi)的酶，可以清除體內(nèi)超氧陰離子自由基。逆境脅迫下，植物體內(nèi)積累大量超氧陰離子等有害物質(zhì)，導(dǎo)致SOD活性增強(qiáng)，SOD活性顯著升高是植物受到脅迫的一個重要指標(biāo)[20]。由圖6可知，鹽脅迫下12個甜蕎新品種葉片SOD活性有明顯不同的變化趨勢，其中，平蕎2號、T407-8和通蕎2號葉片SOD活性顯著增加，分別比對照增加了26.55%，38.41%和22.13%，說明這3個甜蕎品種的抗逆性較強(qiáng)；而定甜蕎3號和赤甜蕎1號葉片SOD活性顯著降低，分別比對照降低了24.99%和33.40%，說明這2個甜蕎品種的抗逆性較弱；其他7個甜蕎品種葉片SOD活性與對照相比無顯著差異。

圖6 鹽脅迫對12個甜蕎新品種葉片SOD活性的效應(yīng)Fig.6 Effect of salt stress on leaf SOD activities of twelve new common buckwheat varieties

2.7 鹽脅迫對12個甜蕎新品種根部FtNHX1表達(dá)量的效應(yīng)

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是負(fù)責(zé)Na+、H+交換的一種跨膜運(yùn)輸?shù)鞍祝谥参锛?xì)胞離子運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，是植物耐鹽的關(guān)鍵因子[21]。由圖7可知，鹽脅迫下，12個甜蕎新品種根部FtNHX1表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢，其中，平蕎2號、T407-8、通蕎2號、甜蕎1307-179和赤甜蕎2號根部FtNHX1表達(dá)量顯著增加，分別比對照增加了84.12%，58.51%，68.37%，51.42%和67.33%，平蕎2號增加幅度最大，說明這5個甜蕎品種根部FtNHX1表達(dá)受鹽脅迫正調(diào)控，鹽脅迫下這5個甜蕎品種根部拒Na+能力增加顯著；而定甜蕎3號根部FtNHX1表達(dá)量顯著降低，比對照降低了21.38%，說明定甜蕎3號根部FtNHX1表達(dá)受鹽脅迫負(fù)調(diào)控，鹽脅迫下其根部拒Na+能力降低顯著；其他6個甜蕎品種根部FtNHX1表達(dá)量與對照相比無顯著差異，說明鹽脅迫對這6個甜蕎品種根部FtNHX1表達(dá)量影響較小。

圖7 鹽脅迫對12個甜蕎新品種根部FtNHX1表達(dá)量的效應(yīng)Fig.7 Effect of salt stress on roots relative expression of FtNHX1 in twelve new common buckwheat varieties

3 討論與結(jié)論

隨著工業(yè)污染的加劇及化肥的不當(dāng)使用，土壤次生鹽漬化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，鹽漬化是影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境脅迫因子之一，植物耐鹽性研究受到廣泛重視，大多數(shù)作物種子萌發(fā)和早期幼苗階段對鹽脅迫最為敏感[22-24]。因此，種子發(fā)芽期的耐鹽性鑒定也就成為研究重點。朱毅等[25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加，柳枝稷種子萌發(fā)受到抑制；孫小芳等[26]將NaCl脅迫對棉花種子萌發(fā)和幼苗生長的傷害概括為3個方面：一是滲透脅迫，高鹽濃度造成棉花種子吸水進(jìn)程遲緩，發(fā)芽勢小，種子萌動慢；二是離子毒害；三是鹽分對酶活性的抑制。本研究中，鹽脅迫下定甜蕎3號和赤甜蕎1號種子發(fā)芽率及幼苗鮮質(zhì)量降低幅度較大，說明對鹽脅迫較為敏感；而平蕎2號和T407-8種子發(fā)芽率與對照間無顯著差異，且鹽脅迫下這2個甜蕎品種幼苗鮮質(zhì)量顯著增加，說明鹽脅迫對平蕎2號和T407-8生長具有明顯促進(jìn)效應(yīng)，這2個甜蕎品種的耐鹽性較強(qiáng)。

植物細(xì)胞正常代謝過程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，活性氧水平很低，不會傷害細(xì)胞，當(dāng)植物受到脅迫時，活性氧累積過多，這個平衡就會被打破，活性氧的化學(xué)性質(zhì)極其活潑，氧化能力很強(qiáng)，可與植物組織中幾乎全部生物大分子進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化，膜的完整性被破壞[27]；丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA含量與過氧化傷害程度密切相關(guān)，MDA含量變化是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一[28]。本研究中，鹽脅迫下定甜蕎3號、赤甜蕎1號和甜蕎1307-179葉片質(zhì)膜透性和MDA含量增加幅度較大；而平蕎2號和T407-8葉片質(zhì)膜透性與對照間無顯著差異，且葉片MDA含量增加幅度相對較小，說明鹽脅迫對這2個甜蕎品種的葉片膜結(jié)構(gòu)傷害較小，平蕎2號和T407-8的耐鹽性較強(qiáng)。

陳炳東等[29]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鹽脅迫下油葵根系活力明顯增加，而高濃度鹽脅迫下其根系活力顯著下降。脅迫條件下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧基團(tuán)(ROS)，超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的重要清除劑，對機(jī)體氧化和抗氧化平衡起著關(guān)鍵作用，可以有效防止ROS對生物的傷害[30-31]。本研究中，鹽脅迫下平蕎2號和T407-8根系活力降低幅度較小，且這2個甜蕎品種葉片SOD活性顯著增加，說明這2個甜蕎品種的抗逆性較強(qiáng)；而定甜蕎3號和赤甜蕎1號根系活力和葉片SOD活性降低幅度較大，抗逆性較弱。

根部是植物吸收Na+的首要和重要部位，Na+從土壤溶液進(jìn)入植物根系表皮和皮層細(xì)胞的過程受Na+濃度差或電勢差的控制，Na+在根部的凈積累是Na+被動流入與主動輸出達(dá)到動態(tài)平衡的結(jié)果，耐鹽植物限制Na+向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)與其根部對Na+的滯留有密切關(guān)系[32]；NHX可將細(xì)胞質(zhì)中Na+區(qū)隔化到液泡，在植物拒Na+過程中發(fā)揮重要作用[33]。本研究中，鹽脅迫下定甜蕎3號根部FtNHX1表達(dá)量顯著降低，說明定甜蕎3號根部FtNHX1表達(dá)受鹽脅迫負(fù)調(diào)控，鹽脅迫下定甜蕎3號根部拒Na+能力顯著降低；而平蕎2號和T407-8根部FtNHX1表達(dá)量顯著增加，說明這2個甜蕎品種根部FtNHX1表達(dá)受鹽脅迫正調(diào)控，鹽脅迫下根部拒Na+能力顯著增加，可以有效限制Na+向地上部運(yùn)輸，耐鹽性強(qiáng)。

總之，通過對種子萌發(fā)、幼苗生長、根系活力、葉片質(zhì)膜透性、MDA含量、SOD活性及FtNHX1基因表達(dá)量等指標(biāo)的綜合分析可知，平蕎2號和T407-8為甜蕎耐鹽品種，定甜蕎3號和赤甜蕎1號為鹽敏感品種。