煙草K+通道NtSKOR基因的克隆及表達(dá)分析

卓 維，陳 倩，楊尚諭，李佳皓，彭 雙，王 靜，李立芹

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.作物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

鉀是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)元素之一，在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞光合作用、氣孔調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成、氧化代謝和抗逆性等生理過(guò)程中起積極作用，嚴(yán)重缺鉀時(shí)植物不能正常完成生活史[1-3]。鉀離子(K+)廣泛分布于植物組織和器官中，其總量在新鮮植物組織細(xì)胞內(nèi)高達(dá)100～200 mmol/L，在植物干質(zhì)量時(shí)可占總含量的2%～10%[4-5]。K+是作物產(chǎn)量與品質(zhì)形成的限制因素。

煙草屬于茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)，是我國(guó)重要的模式植物和農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物。同時(shí)，它也是典型的喜鉀植物，其煙葉中積累的K+含量高低是衡量煙葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，具體表現(xiàn)在鉀素提高煙葉燃燒性、改善煙葉顏色，促進(jìn)糖類和芳香類物質(zhì)的合成與積累等[6]。但是與國(guó)外優(yōu)質(zhì)煙葉相比，我國(guó)煙葉鉀含量普遍偏低，鉀素資源相對(duì)貧乏，除低鉀脅迫以外，干旱、鹽堿、冷害等非生物脅迫也嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。

鉀離子通道是植物吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的細(xì)胞膜蛋白[8]。根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，可分為Shaker、KCO與CNGC這3個(gè)家族。其中，Shaker家族是研究最深入的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)家族之一，該蛋白家族成員在介導(dǎo)植物鉀營(yíng)養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和維持細(xì)胞K+動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程發(fā)揮重要作用[9-10]。植物中完整的Shaker鉀離子通道含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(S1～S6)，其中S4可感受跨膜的電壓變化，從而控制通道的開(kāi)合。S5與S6之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)高度保守，是離子傳導(dǎo)孔區(qū)[11]。Shaker家族按照電壓依賴性及K+運(yùn)輸方向等差異分為內(nèi)整流型、外整流型和弱內(nèi)整流型3種類型。而SKOR(Stelar K+outwaed rectifier)屬于Shaker通道家族的外整流型，可介導(dǎo)K+外流至胞外，但目前針對(duì)它的研究較少。SKOR基因最早從擬南芥中克隆到，研究發(fā)現(xiàn)，它在根中柱組織特異表達(dá)，能被脫落酸抑制，同時(shí)介導(dǎo)根細(xì)胞中K+向木質(zhì)部外流的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)在煙草中研究SKOR的功能。對(duì)于其他外整流型K+通道基因，第一個(gè)從植物細(xì)胞中篩選出的是KCO1，主要在低親和吸收系統(tǒng)中發(fā)揮作用，該基因廣泛分布于植物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)葉紅砂RtKCO1在根、莖、葉中表達(dá)，且在25～50 mmol/L KCl處理下表達(dá)量顯著增加，推測(cè)該基因編碼低親和性K+通道[13]。后在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GORK基因，GORK與SKOR同源性很高，在氣孔關(guān)閉時(shí)，二者可介導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞K+外流，實(shí)現(xiàn)鉀的根-冠分配[14]。

為進(jìn)一步探討外整流K+通道SKOR基因的功能，本研究從普通煙草K326中克隆到一個(gè)NtSKOR基因，利用生物信息學(xué)對(duì)NtSKOR蛋白進(jìn)行相關(guān)分析，同時(shí)運(yùn)用qRT-PCR研究其組織表達(dá)水平，以及6種非生物逆境脅迫對(duì)SKOR基因表達(dá)豐度的影響，為以后研究SKOR提高煙葉中鉀含量以及煙草抗逆性的研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

試驗(yàn)植物材料為煙草栽培品種K326(Nicotianatabacumcv.K326)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自Vazyme Biotech公司；目的基因的克隆及回收使用的TRIzol試劑、高保真Pfu酶、PMD19-T載體和限制性內(nèi)切酶，以及qRT-PCR使用的SYBR Green Master mix和cDNA合成試劑盒等試劑購(gòu)自TaKaRa，DNA凝膠純化回收試劑盒購(gòu)自天根公司；引物合成與測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理 挑選均一飽滿的煙草種子表面消毒、布種，消毒方法和配置培養(yǎng)基方法參考張雪薇等[15]方法進(jìn)行，配置NaCl(200 mmol/L)、PEG-6000(5%)、ABA(1 μmol/L)、H2O2(10 mmol/L)和低鉀10 μmol/L K+培養(yǎng)基。處理相應(yīng)時(shí)間(0，3，6，12，24 h)后進(jìn)行整株取樣，提取RNA后分析NtSKOR在6種非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式。提取煙草K326幼苗的根、莖、葉以及盛花期的花RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后分析NtSKOR在各個(gè)組織的表達(dá)情況。

1.2.2 煙草NtSKOR基因的克隆 參考GenBank收錄的美花煙草(Nicotianasylvestris)NsSKOR序列(XM_009764356.1)，采用同源克隆的方法，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物NtSKOR-F和NtSKOR-R，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 40 s，34個(gè)循環(huán)。目的片段純化后與pMD19-T載體16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，隨后在含有氨芐青霉素(Ampicillin)的LB固體平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 煙草NtSKOR蛋白生物信息學(xué)分析 利用ExPASyProt Param tool分析NtSKOR蛋白的理化性質(zhì)；用SOPMA和SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用PRED-TMR進(jìn)行目的基因的跨膜區(qū)分析；運(yùn)用MEGA 5以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 煙草NtSKOR基因的表達(dá)分析 根據(jù)基因序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物NtSKOR-qF和NtSKOR-qR，采用煙草的18S rRNA為內(nèi)參進(jìn)行表達(dá)差異研究(表1)。qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 NtSKOR基因克隆

以煙草K326葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，在2 000～3 000 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，結(jié)果顯示，1-7為陽(yáng)性克隆(圖2)。將鑒定出的陽(yáng)性克隆隨機(jī)挑選3個(gè)送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段大小為2 484 bp。

2.2 NtSKOR基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 NtSKOR編碼蛋白的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析顯示，NtSKOR基因共編碼827個(gè)氨基酸，其中亮氨酸Leu(11.0%)含量最高，色氨酸Trp(1.2%)含量最低，帶負(fù)電荷氨基酸(Asp + Glu)105個(gè)，帶正電荷氨基酸(Arg + Lys)100個(gè)。該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為94.75 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.52，其親水性平均指數(shù)為-0.149，該蛋白屬于親水性蛋白。

M.Marker 5 000 bp；1.NtSKOR基因。 M.Marker 5 000 bp； 1.NtSKOR gene.

M.Marker 5 000 bp；1-7.NtSKOR基因菌落PCR；8.陽(yáng)性對(duì)照。 M.Marker 5 000 bp； 1-7.NtSKOR colony PCR product； 8.Positive control.

2.2.2 NtSKOR蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA對(duì)NtSKOR編碼的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白中43.41%的氨基酸參與α-螺旋(Alpha helix)，26.96%的氨基酸參與無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)，19.23%的氨基酸參與延伸鏈(Extended strand)，10.40%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)，由此可見(jiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的最大元件為α-螺旋。運(yùn)用 SWISS-MODEL對(duì)NtSKOR的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，用RasTop軟件進(jìn)行顯示，并將結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果較為統(tǒng)一(圖3)。

圖3 NtSKOR 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary structure and tertiary structure prediction of NtSKOR protein

2.2.3 NtSKOR編碼蛋白的跨膜區(qū)及磷酸化分析 運(yùn)用PRED-TMR對(duì)NtSKOR編碼蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，NtSKOR所編碼的827個(gè)蛋白中含有6個(gè)跨膜區(qū)(S1～S6)(圖4)。S1跨膜區(qū)從第86-105位氨基酸結(jié)束，S6跨膜區(qū)從第687-704位氨基酸結(jié)束。

利用NetPhos3.1 Server在線工具對(duì)NtSKOR蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，NtSKOR中含有41個(gè)絲氨酸(Serine)激酶磷酸化位點(diǎn)，22個(gè)蘇氨酸(Threonine)激酶磷酸化位點(diǎn)和9個(gè)酪氨酸(Tyrosine)激酶磷酸化位點(diǎn)(圖5)。說(shuō)明此蛋白能被激酶所磷酸化，從而參與其他生理過(guò)程的調(diào)控。

S1～S6為NtSKOR蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。 S1-S6 is the amino acid sequence of the transmembrane structure of NtSKOR protein.

圖5 NtSKOR蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.5 Predicted phosphorylation site of NtSKOR protein

2.2.4 NtSKOR同源性分析 把NtSKOR編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，按照相似性程度高低選擇19個(gè)基因編碼的氨基酸序列(包括NtSKOR)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)，結(jié)果表明，NtSKOR與美花煙草(XP_009762658.1)、絨毛狀煙草(XP_009609577.1)、甜椒 (XP_016573164.1)等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為99%，96%，89%；與橡膠樹(shù) (XP_021654878.1)和錦葵(XP_021298261.1)的同源性最低，分別為73%和74%。

2.3 NtSKOR的組織表達(dá)分析

采用qRT-PCR反應(yīng)分析NtSKOR的組織表達(dá)情況，結(jié)果表明，NtSKOR在煙草根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但主要是在根中表達(dá)，莖和葉中表達(dá)稍低，在花中的表達(dá)量最低。其中，根中表達(dá)量是在莖中的1.23倍，是葉中的1.83倍，是花中的13.11倍。說(shuō)明煙草NtSKOR主要在根中表達(dá) (圖7)。

圖6 NtSKOR進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 The phylogenetic tree analysis of NtSKOR

不同處理間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。圖8同。 Different treatments with Different lowercase mean significant difference. The same as Fig.8.

2.4 六種非生物逆境脅迫下 NtSKOR 的表達(dá)分析

采用qRT-PCR分析NtSKOR在6種處理后的表達(dá)情況。在低鉀(10 μmol/LK+)處理后，該基因表達(dá)量在3～24 h下降，最低值為對(duì)照(0 h)的6.19%；高鹽(200 mmol/L NaCl)、10 mmol/L H2O2和1 μmol/L ABA處理后，NtSKOR表達(dá)量在3～24 h逐漸增加，最高值都出現(xiàn)在24 h，分別為對(duì)照(0 h)的1.86，3.11和18.69倍；在5% PEG-6000處理后，該基因表達(dá)先升高后降低，最高值出現(xiàn)在6 h，為對(duì)照(0h)的2.56倍。但冷處理(4 ℃)下，NtSKOR表達(dá)量在3～12 h隨處理時(shí)間增加而下降，最低值出現(xiàn)在12 h，僅為對(duì)照的16.20%，但24 h時(shí)出現(xiàn)大幅度上升，為對(duì)照的76.13%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，NtSKOR能夠響應(yīng)逆境脅迫，受到NaCl、PEG-6000、H2O2和ABA誘導(dǎo)，也受到低鉀和4 ℃處理抑制(圖8)。

圖8 NtSKOR在6種非生物逆境脅迫下的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.8 Analysis of relative expression of NtSKOR under six abiotic stresses

3 討論

植物吸收K+經(jīng)木質(zhì)部流入地上部分的過(guò)程主要起作用的是Shaker家族外整流K+通道[16-17]。其功能是當(dāng)植物受到高濃度鉀脅迫時(shí)，可通過(guò)增加其轉(zhuǎn)錄水平，合成通道蛋白排除多余的鉀離子；而當(dāng)植物受到鉀饑餓脅迫時(shí)，鉀通道基因表達(dá)量下降，轉(zhuǎn)錄受到抑制，防止所必需的鉀離子流失[18-20]。SKOR是擬南芥去極化激活的K+通道，最早有研究者提出假說(shuō)：鹽脅迫下，木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中積累Na+會(huì)引起薄壁細(xì)胞質(zhì)膜去極化，從而激活外整流K+通道蛋白(SKOR)選擇性離子(NOR)活性，進(jìn)而將K+裝載到木質(zhì)部向地上部運(yùn)輸，后在擬南芥中分離得到AtSKOR基因，證明了這一結(jié)論[21]。其他研究發(fā)現(xiàn)，SKOR對(duì)細(xì)胞外pH值和H2O2敏感，pH值變化可以改變活化的通道數(shù)量，H2O2能迅速增強(qiáng)SKOR的電流振幅和活性[22-23]。

但是長(zhǎng)期以來(lái)，有關(guān)外整流通道蛋白的研究以及鉀吸收主要集中在擬南芥上，其他植物研究較少[24]。本試驗(yàn)從普通煙草K326中克隆到一個(gè)NtSKOR基因的cDNA序列，該基因全長(zhǎng)2 484 bp，編碼827個(gè)氨基酸殘基。NtSKOR蛋白能夠被絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶磷酸化，與美花煙草、甜椒和番茄SKOR等具有較高同源性，同時(shí)含有(S1～S6)6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。第6個(gè)跨膜螺旋S6與鉀通道的門控相關(guān)，通過(guò)定點(diǎn)誘變AtSKOR基因，發(fā)現(xiàn)影響門控的突變聚集在S6內(nèi)，S6跨膜區(qū)及其細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)展區(qū)域與通道阻斷劑的相互作用是調(diào)節(jié)門控的重要機(jī)制[25-26]。

本研究利用qRT-PCR分析NtSKOR在煙草K326不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，該基因在根、莖、葉、花中均有表達(dá)，根中表達(dá)量最高，莖和葉中稍低。這與植物霸王ZxSKOR的組織表達(dá)情況一樣，該基因主要在根和莖中表達(dá)，且ZxSKOR表達(dá)水平隨葉片中K+的濃度增加而顯著提高，認(rèn)為在鹽脅迫下根和莖中的ZxSKOR相互協(xié)調(diào)在K+的長(zhǎng)距離運(yùn)輸起作用[27]。推測(cè)NtSKOR可能參與煙草根部K+離子的吸收與運(yùn)輸，以維持體內(nèi)離子平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，在低鉀(10 μmol/L K+)處理后，該基因表達(dá)量在3～24 h逐漸下降；高鹽(200 mmol/L NaCl)處理后，NtSKOR表達(dá)量在3～24 h逐漸增加，說(shuō)明NtSKOR表達(dá)量受到低鉀處理抑制和高鹽誘導(dǎo)，推測(cè)與Shaker家族在響應(yīng)低鉀脅迫的適應(yīng)機(jī)制相關(guān)。低鉀濃度(1～200 μmol/L)下，NtSKOR基因轉(zhuǎn)錄受到抑制以防止K+流失。巴西橡膠樹(shù)HbKCO1在鉀饑餓和高鉀脅迫下表達(dá)模式與外整流K+通道適應(yīng)機(jī)制相符合，30 mmol/L KCl高鉀處理后HbKCO1表達(dá)量上升，低鉀處理后表達(dá)量下降[28]。同時(shí)，煙草NtSKOR基因表達(dá)受高鹽誘導(dǎo)，這與霸王ZxSKOR的表達(dá)模式相同，50 mmol/L NaCl處理下，基因表達(dá)豐度隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加[29]。猜測(cè)該表達(dá)模式與維持植物體內(nèi)正常K+/Na+平衡相關(guān)，但是基因表達(dá)與K+吸收之間的聯(lián)系，不同的植物表達(dá)模式不一樣[30-31]。在小花堿茅PtSKOR的研究中發(fā)現(xiàn)，小花堿茅地上部分K+的含量不受外界鹽分濃度及處理時(shí)間的影響，這是維持植株地上部高K+/Na+值的重要原因之一[32]。黑果枸杞LrSKOR的耐鹽機(jī)制表明，黑果枸杞Na+和K+主要分布在地上部分，但根中K+/Na+的值比葉片中高，從而表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的耐鹽能力[33]。

本試驗(yàn)選擇6種不同的處理以研究NtSKOR的表達(dá)模式，在不同的脅迫條件，該基因表達(dá)情況不同，推測(cè)SKOR基因面對(duì)相同或不同的逆境存在不同的應(yīng)答機(jī)制，可能是存在翻譯后水平調(diào)控，也有可能是與不同蛋白相互作用的結(jié)果。所以，煙草NtSKOR蛋白在吸收鉀素和對(duì)抗非生物逆境脅迫中的具體作用，尚待進(jìn)一步研究。今后可構(gòu)建GFP融合表達(dá)蛋白，確定其亞細(xì)胞定位，構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)蛋白，深入研究NtSKOR基因的功能，為從分子水平闡明NtSKOR蛋白在非生物逆境脅迫特別是低鉀脅迫中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。