過表達(dá)CsMADSs擬南芥的表型變化及CsMADSs表達(dá)水平

安玉蘭，翟克清，楊 峰，雷 玥，胡克玲，甘德芳，汪承剛

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，安徽省園藝作物育種工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

黃瓜(CucumissativusL.)是葫蘆科一年生攀援草本植物，是夏季主要蔬菜之一，全國(guó)各地均有栽培。MADS-box家族基因是一類編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。研究表明，MADS-box家族基因在植物根的營(yíng)養(yǎng)吸收、分生組織分化、春化、開花時(shí)間[1]、胚的發(fā)育及果實(shí)成熟[2]等方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。其中，研究較多的是MADS-box基因參與花器官及果實(shí)的發(fā)育[6-8]。如過量表達(dá)BrAGL20基因能促進(jìn)油菜提早開花[9]；劉勵(lì)蔚等[10]采用花粉管通道法將白樺花發(fā)育基因BmMADS3導(dǎo)入玉米自交系中，能使玉米花期提前，與產(chǎn)量相關(guān)的性狀如穗重、穗長(zhǎng)、穗粗和百粒重等均顯著提高；位偉強(qiáng)等[11]從洛陽(yáng)紅牡丹花芽中克隆得到1個(gè)開花調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因PsFUL1，其在牡丹花芽和花瓣中表達(dá)量最高，在其他器官中表達(dá)水平較低或不表達(dá)。擬南芥的MADS-box基因有100多個(gè)，其在花器官的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[12]，但超過80%的MADS-box基因功能是未知的[13]。因此，越來越多的研究人員開始關(guān)注MADS-box基因在花器官發(fā)育以外的功能。近年來，已發(fā)現(xiàn)MADS-box基因在植物花色素苷合成[14]、抗逆性[15-16]、根結(jié)構(gòu)、芽休眠[17]、葉片發(fā)育方面都發(fā)揮著重要的作用。番茄AGAMOUS-LIKE1基因參與番茄果皮的形成，沉默TAGL1基因會(huì)明顯降低番茄果皮厚度和硬度[18]。Yu等[19]認(rèn)為AGL21能夠促進(jìn)擬南芥?zhèn)雀纳扉L(zhǎng)，從而調(diào)控側(cè)根發(fā)育。葡萄MADS-box家族的FUL同源基因(AP1及VFUL-L)能促進(jìn)葡萄卷須的分化與發(fā)育[20-21]。SLMBP11(AGL15亞家族成員)能顯著降低番茄的株高、葉面積、節(jié)間長(zhǎng)度，增加葉腋的分枝數(shù)、節(jié)點(diǎn)和葉片數(shù)[22]。目前，有關(guān)黃瓜MADS-box家族基因的研究較少，主要集中在調(diào)控黃瓜花器和果實(shí)發(fā)育方面。龔霞峰[23]研究表明，抑制黃瓜CUM1基因(AGAMOUS同源基因)的表達(dá)會(huì)延遲黃瓜開花，而過表達(dá)CUM1會(huì)使黃瓜花的雄蕊退化，推測(cè)CUM1基因可能參與黃瓜雄蕊和心皮的發(fā)育。過表達(dá)ERAF17基因(受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的控制植物花器發(fā)育的MADS-box基因)的黃瓜植株只產(chǎn)生雄花，沒有雌花生成[24]。王鑫[25]以EMS誘變得到的黃瓜花器和果實(shí)發(fā)育的突變體為材料，結(jié)合高通量測(cè)序分析，定位了1個(gè)黃瓜花發(fā)育相關(guān)的基因CsSEP2(Csa4G126990)。課題組前期研究表明，黃瓜CsMADS08(Csa4G126480.1)基因在各器官都有表達(dá)，而CsMADS21(Csa6G367090.1)主要在葉、花及幼果中表達(dá)[26-27]，但CsMADSs基因的生物學(xué)功能仍然未知。本研究構(gòu)建黃瓜CsMADSs(CsMADS08和CsMADS21)基因的真核表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，利用熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)CsMADSs基因在煙草細(xì)胞中的定位；同時(shí)通過花序侵染轉(zhuǎn)化擬南芥，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因后代擬南芥的表型變化，并研究CsMADSs在過表達(dá)擬南芥植株中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討黃瓜CsMADSs基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

津綠1號(hào)黃瓜(天津市綠豐園藝新技術(shù)開發(fā)有限公司)購(gòu)自合肥先鋒種業(yè)，擬南芥、煙草種子、pCAMBIA1305載體與P19菌株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞、凝膠回收試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CsMADSs基因克隆

采用Trizol試劑法提取黃瓜葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用引物P1/P2和P3/P4(表1)分別擴(kuò)增CsMADS08和CsMADS21序列，回收目的片段。連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，取陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1CsMADSs、Gus及Hyg基因擴(kuò)增的引物序列及其參數(shù)

Table1Primer sequences and parameters ofCsMADSs，GusandHyg

引物Primer引物序列Primer sequence作用FunctionP1P2P3P4Hyg-FHyg-RGUS-FGUS-RMADS08-FMADS08-RMADS21-FMADS21-RActin-FActin-RCCA-GGATCC-ATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCCCCCC-GTCGAC-TTACCCAAATGATAAAGAAGGGAGGG-GGATCC-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCAAGGCG-GTCGAC-TTACCCAATGTTTAGAGAGGGATGCTTCTGCGGGCGATTTGTGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGCCCTTCACTGCCACTGACCGAGAATAGGCAGCTAGCGAAG-AAAGAAGGGATTGGTGGTGGAGAACAATGTCCAACTGGCAGGAGGTGGTGGGAATAAGAGCACCAAGCAGCATGAAGAGAACCACCGATCCAGACACT擴(kuò)增CsMADS08基因For CsMADS08 gene amplification擴(kuò)增CsMADS21基因For CsMADS21 gene amplification擴(kuò)增Hyg基因特異片段For Hyg fragment amplification擴(kuò)增Gus基因特異片段For Gus gene fragment amplificationCsMADS08基因熒光定量引物Fluorescence quantitative primers for CsMADS08CsMADS21基因片段熒光定量引物Fluorescence quantitative primers for CsMADS21Actin2基因熒光定量引物Fluorescence quantitative primers for Actin2

1.2.2 過表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化

利用BglⅡ、SalⅠ雙酶切pCAMBIA1305-GFP載體[28]，回收大片段；利用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD19-T-CsMADSs，回收小片段CsMADSs。采用T4連接酶連接過夜，連接液轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADS08及pCAMBIA1305-CsMADS21。凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。挑取農(nóng)桿菌單克隆提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。挑選陽(yáng)性克隆搖菌，-70 ℃冰箱保存，用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草和侵染擬南芥。

1.2.3 亞細(xì)胞定位

取pCAMBIA1305-CsMADSs農(nóng)桿菌菌液及P19菌株分別搖菌，并按比例混合菌液，離心10 min，收集菌體。加入2 mL處理液(0.5 mol·L-1MES 200 μL，1 mol·L-1MgCl2100 μL，100 mmol·L-1乙酰丁酮10 μL，加水至10 mL)，吹打混勻，然后注射6葉期的煙草葉片，濕潤(rùn)避光環(huán)境下培養(yǎng)36～48 h。取煙草幼葉，切割成0.5 cm × 0.5 cm，平鋪在載玻片上，加幾滴蒸餾水蓋好蓋玻片并輕壓片，置于共聚焦顯微鏡下掃描拍攝(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)520～550 nm)，觀察GFP在煙草葉片細(xì)胞的分布。

1.2.4 擬南芥種植及侵染

營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按體積比1∶3混勻裝盆，播種擬南芥，待其抽薹開花后進(jìn)行侵染。

取100 μL農(nóng)桿菌菌液，加入45 mL的YEP培養(yǎng)基，培養(yǎng)至D值為0.8。4 ℃ 4 000 r·min-1離心10 min，取菌體加入Buffer(MS 0.11 g，蔗糖2.5 g，MES 0.025 g溶于50 mL純水，調(diào)節(jié)pH值至5.7，加入15 μL表面活化劑Silwet-77，磁力攪拌30 min。)吹打混勻，侵染擬南芥花序，并套袋，共侵染2～3次。待種子成熟進(jìn)行采收(T1代)，置于37 ℃烘干，4 ℃保存。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及表型觀測(cè)

稱取30 mg T1代種子，75%乙醇消毒1 min，再用滅菌水清洗3次，然后用0.1%滅菌瓊脂糖懸浮種子，均勻平鋪于含30 mg·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上。以野生型為對(duì)照。待植株長(zhǎng)到6片葉時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的抗性植株移栽到盆中。7 d后，利用DNA提取試劑盒提取葉片基因組DNA，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因Hyg、Gus報(bào)告基因及目的基因CsMADS08和CsMADS21。經(jīng)檢測(cè)呈陽(yáng)性的植株按單株收獲種子(T2代)，其余后代按同樣方式篩選種植直至獲得純合植株，觀察和鑒定各世代植株的表型。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥CsMADSs的表達(dá)分析

采用Trizol法提取T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型擬南芥花期各器官(根、莖、葉、花)的總RNA，用微量核酸測(cè)定儀(ND2000)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度及濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser除去基因組DNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照SYBR Premix ExTaqⅡ (寶生物染料法熒光定量試劑盒)說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系如下：SYBR Green Master mix 12.5 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，cDNA原液0.9 μg，加RNase free H2O至25 μL。以擬南芥Actin2(AT3G18780)基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試樣重復(fù)4次，以非轉(zhuǎn)化株為對(duì)照。qPCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及載體構(gòu)建

提取黃瓜葉片總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別以P1/P2和P3/P4為引物，擴(kuò)增得到約650 bp的片段，回收目的片段，連接pMD19-T載體，經(jīng)測(cè)序得到的CsMADS08和CsMADS21長(zhǎng)度分別為633 bp和645 bp。利用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD19-T-CsMADSs，連接到經(jīng)BglⅡ、SalⅠ雙酶切的pCAMBIA1305載體中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果(圖1)表明，目的基因已經(jīng)成功連接到pCAMBIA1305載體中。

M，DL 2 000 DNA marker; A，CsMADS08; B，CsMADS21.圖1 重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADSs的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR amplification of recombinant plasmid pCAMBIA1305-CsMADSs

2.2 煙草亞細(xì)胞定位

利用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)CsMADSs在煙草葉片細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果(圖2)顯示，CsMADS08定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上(圖2-A)，CsMADS21定位于細(xì)胞膜上(圖2-B)，對(duì)照pCAMBIA1305空載體定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上(圖2-C)。

2.3 過表達(dá)擬南芥植株陽(yáng)性株的篩選

取T1代擬南芥種子，經(jīng)消毒后平鋪于含30 mg·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基中，以野生型為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型植株均出現(xiàn)黃化直至死亡，大部分T1代植株表現(xiàn)出與野生型相似的表型，只有少數(shù)植株生長(zhǎng)正常。將生長(zhǎng)健壯的植株移栽于營(yíng)養(yǎng)缽中，精細(xì)管理，供后續(xù)檢測(cè)。

A，CsMADS08；B，CsMADS21；C，pCAMBIA1305載體；D～F，煙草葉片明場(chǎng)對(duì)照?qǐng)D。A，CsMADS08; B，CsMADS21; C，pCAMBIA1305 vector; D-F, Contrast picture of tabacco leaves in open field.圖2 CsMADSs基因在煙草葉片的亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular localization of CsMADSs in tobacco leaf

提取潮霉素抗性植株的葉片DNA，PCR分別擴(kuò)增潮霉素抗性基因和Gus基因。其中，轉(zhuǎn)CsMADS08基因的抗性植株，利用潮霉素抗性基因及CsMADS08基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有目的條帶(圖3-A，3-C)。轉(zhuǎn)CsMADS21的抗性植株，利用潮霉素抗性基因、CsMADS21及Gus報(bào)告基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，分別得到相應(yīng)的擴(kuò)增條帶(圖3-B，3-C，3-D)。

2.4 過表達(dá)擬南芥植株后代的表型變化

在T2、T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，過表達(dá)CsMADS21的擬南芥植株，主莖的花序發(fā)育比野生型早5～6 d(圖4-A)；同時(shí)植株葉片顏色加深，呈紫色(圖4-B)，且側(cè)枝數(shù)增加，側(cè)生花序及果莢數(shù)都較野生型多(圖4-D)。而過表達(dá)CsMADS08的擬南芥植株，幼苗期出現(xiàn)大量的蓮座葉，同時(shí)側(cè)枝上出現(xiàn)大量蓮座狀叢生葉片(圖4-C)，甚至果莢成熟后，依然有新的蓮座狀的莖生葉抽出(圖4-E)，側(cè)枝數(shù)減少，果莢數(shù)減少(圖4-D)；植株也出現(xiàn)葉片顏色加深，呈紫色。提取過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型擬南芥葉片的花青素，結(jié)果顯示，過表達(dá)植株葉片的花青素含量均比野生型高，達(dá)到顯著差異(結(jié)果未列出)。

與野生型植株相比，T4代轉(zhuǎn)CsMAD08的擬南芥植株出現(xiàn)了表型分化。一種表現(xiàn)為株型矮化、分枝數(shù)多，分枝細(xì)弱；另一種則出現(xiàn)植株蓮座葉增多，莖上著生蓮座狀葉片，葉片多而分枝少的現(xiàn)象(圖5)。

2.5 過表達(dá)擬南芥植株中CsMADSs的組織特異性表達(dá)

采用Trizol法提取T3代植株各器官總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CsMADS08和CsMADS21的表達(dá)情況。結(jié)果表明：過表達(dá)CsMADS08的擬南芥植株，目的基因在莖中表達(dá)量較高，在其他器官中的表達(dá)量較低(圖6-A)；過表達(dá)CsMADS21的擬南芥植株，目的基因在花中表達(dá)量較高，在根、莖、葉中表達(dá)量較低(圖6-B)。

A: 1～3，轉(zhuǎn)CsMADS08植株的潮霉素基因擴(kuò)增；4，陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)化株)。B: 1～4，轉(zhuǎn)CsMADS21植株的潮霉素基因擴(kuò)增；5，陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)化株)。C: 1，pCAMBIA1305-CsMADS08質(zhì)粒的CsMADS08擴(kuò)增；2，過表達(dá)擬南芥植株的CsMADS08擴(kuò)增；3，陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)化株)；4，pCAMBIA1305-CsMADS21質(zhì)粒的CsMADS21擴(kuò)增；5，過表達(dá)擬南芥植株的CsMADS21擴(kuò)增。D: 1～4，轉(zhuǎn)CsMADS21植株的Gus基因擴(kuò)增；5，陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)化株)。A: 1-3，Hyg gene amplification of CsMADS08 transgenic plants; 4，Negative control (non-transgenic plants). B: 1-4，Hyg gene amplification of CsMADS21 transgenic plants; 5，Negative control (non-transgenic plants). C: 1，Amplification of CsMADS08 in pCAMBIA1305-CsMADS08 plasmids; 2，Amplification of CsMADS08 in CsMADS08 transgenic plants; 3，Negative control (non-transgenic plants); 4，Amplification of CsMADS21 in pCAMBIA1305-CsMADS21 plasmids; 5，Amplification of CsMADS21 in CsMADS21 transgenic plants. D: 1-4，Gus gene amplification of CsMADS21 transgenic plants; 5，Negative control (non-transgenic plants).圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR電泳圖Fig.3 Electrophoresis map of Arabidopsis transgenic plants

A：野生型擬南芥(左)，轉(zhuǎn)CsMADS21擬南芥(右)；B：上為過表達(dá)擬南芥植株呈紫色，下為野生型擬南芥；C：過表達(dá)CsMADS08擬南芥的蓮座狀莖生葉；D：左為野生型，中為過表達(dá)CsMADS21擬南芥，右為過表達(dá)CsMADS08擬南芥；E：左為野生型，右為過表達(dá)CsMADS08擬南芥的莖生葉。A: Wild type in left，CsMADS21 transgenic plants in right; B: CsMADS21 transgenic plants on the top and wild type are below; C: Cauline leaves of CsMADS08 transgenic plants; D: Wild type in left，CsMADS21 transgenic plants in middle，CsMADS08 transgenic plants in right; E: Wild type in left，cauline leaves of CsMADS08 transgenic plants in right.圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型變化Fig.4 Phenotypic variation of Arabidopsis transgenic plants

左：野生型擬南芥；中和右：轉(zhuǎn)CsMADS08擬南芥。Left，Wild type; Middle and right，CsMADS08 transgenic plants.圖5 T4代轉(zhuǎn)CsMADS08擬南芥的表型分離Fig.5 Phenotypic segregation of T4 CsMADS08 Arabidopsis transgenic plants

3 討論

3.1 過表達(dá)CsMADSs擬南芥植株的表型變化及分離

過表達(dá)CsMADS08的擬南芥植株，主莖剛抽出時(shí)，其蓮座葉數(shù)目增加，莖生葉也呈現(xiàn)叢生狀?；ㄐ虺樯鷷r(shí)，側(cè)枝數(shù)目少，果莢較野生型瘦弱，株型較矮。在生長(zhǎng)后期，側(cè)枝上出現(xiàn)大量的蓮座狀葉片，側(cè)枝果莢數(shù)目少，果莢較短，較瘦癟。在野生型植株完全成熟后，同期過表達(dá)CsMADS08的擬南芥植株側(cè)枝上還會(huì)有新的蓮座葉出現(xiàn)。過表達(dá)CsMADS08的T4代植株表型出現(xiàn)了分化，一種株型矮化、分枝多，枝條細(xì)弱，而另一種則表現(xiàn)為蓮座葉數(shù)目增多而分枝減少。說明CsMADS08基因可能參與調(diào)控植株腋芽的分化方向，分化形成更多的葉片；由于植株不斷產(chǎn)生蓮座狀葉片，致使?fàn)I養(yǎng)流向新生的幼葉，造成植株分枝數(shù)減少，開花和結(jié)莢數(shù)也相應(yīng)減少，果實(shí)得不到足夠的養(yǎng)分供應(yīng)，所以果實(shí)瘦弱干癟。該研究結(jié)果與Guo等[22]的結(jié)果相似，其研究結(jié)果表明番茄MADS-box基因SLMBP11(AGL15亞家族的成員)能顯著降低株高、葉面積、節(jié)間長(zhǎng)度，而葉腋的分枝數(shù)、節(jié)點(diǎn)和葉片數(shù)都增加，推測(cè)該基因可能調(diào)控腋芽的生長(zhǎng)。黃瓜CsMADS08基因如何調(diào)控腋芽的生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。相反，過表達(dá)CsMADS21的擬南芥植株，其主莖開花結(jié)果比野生型早5～6 d，側(cè)枝數(shù)目增加，花序較多，結(jié)莢率高，果莢飽滿。說明CsMADS21可能參與花芽的分化、形成及果實(shí)的發(fā)育，相關(guān)的后續(xù)研究正在進(jìn)行。前期研究結(jié)果表明，黃瓜CsMADS08及CsMADS21屬于AP1-FUL類的MADS-box基因，而且與擬南芥的AtAGL7、AtAGL8及AtAGL79具有較高的同源性[23]。有報(bào)道認(rèn)為，AGL8在擬南芥的果實(shí)發(fā)育及葉片形狀方面起調(diào)控作用[29]，黃瓜CsMADS21的結(jié)果與此相似，但CsMADS08的結(jié)果與此不同。AtAGL7及AtAGL79對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響尚未見報(bào)道。褚婷婷等[30]研究了擬南芥AP1-FUL類基因的表達(dá)調(diào)控模式，發(fā)現(xiàn)FUL啟動(dòng)子的上游存在2個(gè)抑制其表達(dá)的順式作用元件，且FUL基因的第1個(gè)內(nèi)含子參與擬南芥心皮核雄蕊的發(fā)育調(diào)控。

圖6 過表達(dá)擬南芥植株CsMADSs基因的表達(dá)Fig.6 Expression analysis of CsMADSs in Arabidopsis transgenic plants

3.2 過表達(dá)擬南芥植株CsMADSs基因的表達(dá)量變化

MADS-box作為一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與植物許多重要的生物學(xué)過程，尤其在花及果實(shí)的發(fā)育成熟過程中起重要作用。Yin等[31]研究了SIMBP8基因在番茄各器官的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在番茄的老葉、萼片及后期的果實(shí)中高表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SIMBP8干涉轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)能產(chǎn)生較高的乙烯，其成熟時(shí)間比野生型提前2～4 d，說明SIMBP8對(duì)番茄果實(shí)后熟軟化起重要作用。本試驗(yàn)中，過表達(dá)CsMADS08的擬南芥植株，目的基因在莖中有較高的表達(dá)量，在其他器官中表達(dá)量較低，這可能與CsMADS08參與控制腋芽的分化以及蓮座葉的形成相關(guān)，這與Guo等[22]的研究結(jié)果類似。CsMADS08對(duì)莖或側(cè)枝的生長(zhǎng)可能起著負(fù)調(diào)控作用，促使腋芽分化形成更多的葉片，導(dǎo)致植株的營(yíng)養(yǎng)大多流向新生的葉片，造成植株分枝少、結(jié)莢少。而過表達(dá)CsMADS21的擬南芥植株，目的基因在花中有較高的表達(dá)量，而在根、莖、葉中表達(dá)量較低，該結(jié)果與之前各世代在表型上的特征相一致，花期提前、花序多、結(jié)莢率高及果莢飽滿等，進(jìn)一步說明CsMADS21可能參與花的分化及果實(shí)的發(fā)育。至于CsMADS08和CsMADS21在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中的調(diào)控作用還有待于進(jìn)一步研究。