不同水溫下鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾血漿的藥代動(dòng)力學(xué)研究

余琳雪，劉永濤，蘇志俊，丁 浩，艾曉輝，*

(1.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢430223； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430223)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1.2 藥品與試劑及配制方法

鹽酸氯苯胍(純度≥98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，氘代鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，鹽酸氯苯胍原料藥(純度98%，壽光市華弛化工有限公司)。乙腈，乙酸，乙酸乙酯，正己烷，甲酸(色譜純，美國(guó)J.T. Baker公司)。無(wú)水乙醇(分析純，西隴化工股份有限公司)，蒸餾水，可溶性淀粉(分析純，湘中化學(xué)試劑供應(yīng)站)，無(wú)水硫酸鎂(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，肝素鈉(生物級(jí)，上海生化試劑有限公司)。

1.2.1 灌胃液的配制

稱取0.5 g鹽酸氯苯胍，用10 mL乙醇溶解，加2 g淀粉，并用蒸餾水定容至100 mL，制備成濃度為5 mg·mL-1的懸濁液。灌胃前用磁力攪拌器使懸濁液混勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg的鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品和氘代鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，分別加少量甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg·L-1的鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 肝素鈉溶液的制備

稱取0.5 g肝素鈉溶解在50 mL蒸餾水中配成1%的肝素鈉溶液。

1.3 儀器與色譜條件

自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI 20PR-520 型)；Mettler-Toledo AE-240 型精密電子天平(梅特勒-托利多公司)；調(diào)速混勻器(上?？等A生化儀器制造廠)；磁力攪拌器(MS-PA 美國(guó)SCILOGEX)；氮吹儀(AOSHENG，杭州奧盛儀器有限公司)；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SURYEYOR MS PUMP PLUS，SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS，Thermo TSQ QUANTUM ACESS MAX及Thermo LCquan 2. 6 數(shù)據(jù)采集處理軟件)。

色譜柱：Symmetry?C18(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)色譜柱；流速為250 μL·min-1；進(jìn)樣量20.0 μL；柱溫30 ℃。梯度洗脫條件見(jiàn)表1，A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇。

1.4 質(zhì)譜分析條件

采用加熱電噴霧離子源(HESI)，負(fù)離子模式；檢測(cè)方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式；噴霧電壓-3 000 V；鞘氣壓力40 kPa；輔助氣壓力5 kPa；蒸發(fā)氣溫度350 ℃；碰撞氣氬氣，壓力1.5 MPa；離子傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃。母離子，定性離子對(duì)，定量離子對(duì)和碰撞能量見(jiàn)表2。

表1流動(dòng)相梯度洗脫程序

Table 1 Mobile phase gradient elution program %

A，0.1%甲酸水溶液；B，甲醇。

A，0.1% Formic acid aqueous solution; B，Methanol.

1.5 給藥方式及樣品采集

1.6 樣品處理

將血漿樣品在室溫下解凍后，搖勻，準(zhǔn)確吸取1.0 mL于10 mL離心管中，加入50 μL 1 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液氘代鹽酸氯苯胍，加入5 mL 1%甲酸乙酸乙酯溶液，置調(diào)速混勻器上渦旋振蕩30 s，超聲5 min，再加入0.5 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋振蕩30 s，7 104g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一支10 mL離心管中，再向溶液中加入3 mL 1%甲酸乙酸乙酯溶液，渦旋振蕩30 s，7 104g離心5 min，合并兩次上清液于10 mL離心管中，置45 ℃氮吹儀上吹至干，用1 mL定容溶液(A、B體積比30∶70)溶解殘?jiān)?，渦旋振蕩30 s，15 984g離心5 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及回收率與精密度測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：以標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為基礎(chǔ)，配制含氘代鹽酸氯苯胍內(nèi)標(biāo)50 ng·mL-1，鹽酸氯苯胍濃度為0.01、0.05、0.2、0.5、2，5、10、20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作HPLC-MS分析。以測(cè)得的鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍的峰面積比值為縱坐標(biāo)，鹽酸氯苯胍的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

表2鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍質(zhì)譜條件

Table2Mass spectrometry parameters of ROBH and ROBH-D8

藥物Drug母離子Parention子離子Production碰撞能量Collision energy/VROBH331.9152.924194.9*17ROBH-D8339.9156.926198.9*16

*，離子對(duì)為定性離子對(duì)。

*，Qualitative ion pair.

回收率與精密度測(cè)定：在空白血漿中分別添加4個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血漿中鹽酸氯苯胍質(zhì)量濃度分別為1、10、50、100 ng·mL-1，氘代鹽酸氯苯胍的質(zhì)量濃度為50 ng·mL-1。每個(gè)濃度樣品，日內(nèi)做5個(gè)重復(fù)，一周內(nèi)重復(fù)做5次，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線，藥-時(shí)曲線圖采用Microsoft Excel 2013軟件繪制；藥物動(dòng)力學(xué)模型擬合及參數(shù)計(jì)算采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)專業(yè)委員會(huì)編制的3p97藥代動(dòng)力學(xué)程序軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜特征和標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1～20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)鹽酸氯苯胍線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.010 7x+0.019 1，決定系數(shù)R2=0.999 1。

在本試驗(yàn)建立的色譜條件下，基線走動(dòng)平穩(wěn)，鹽酸氯苯胍峰形良好，無(wú)明顯雜質(zhì)峰影響，色譜圖見(jiàn)圖1。鹽酸氯苯胍的出峰時(shí)間為5.69 min，氘代鹽酸氯苯胍的出峰時(shí)間為5.68 min，樣品的分析時(shí)間為9 min。

2.2 回收率、準(zhǔn)確度及精密度考查

以1、10、50和100 ng·mL-14個(gè)添加濃度測(cè)定血漿樣品中鹽酸氯苯胍的平均回收率，分別為(89.43±2.88)%、(88.07±2.57)%、(116.45±1.17)%和(95.22±1.51)%，日內(nèi)變異系數(shù)為3.8%、7.19%、1.09%和4.49%，日間變異系數(shù)4.19%、11.68%、5.88%和6.74%。按3倍信噪比計(jì)算血漿中鹽酸氯苯胍檢測(cè)限為0.5 ng·mL-1，定量限為1 ng·mL-1。

圖1 50 ng·mL-1鹽酸氯苯胍與鹽酸氯苯胍-D8標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液SRM色譜圖(左)和空白血漿加標(biāo)50 ng·mL-1鹽酸氯苯胍與鹽酸氯苯胍-D8 SRM色譜圖(右)Fig.1 SRM chromatogram of 50 ng·mL-1 ROBH and ROBH-D8 standard solution (left) and SRM chromatogram of blank plasma adding 50 ng·mL-1 ROBH and ROBH-D8 (right)

2.3 不同水溫下鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾血漿中藥物濃度的變化

2.4 不同水溫下鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾血漿中藥代動(dòng)力學(xué)特征

圖2 18 ℃和28 ℃水溫條件下鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)的藥時(shí)曲線Fig.2 Concentration-time curve of ROBH in channel catfish plasma at 18 ℃ and 28 ℃

2.5 不同水溫下鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾血漿的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

采用3p97實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)血漿中藥物濃度-時(shí)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明，鹽酸氯苯胍在血漿中的藥動(dòng)學(xué)符合二室模型，其主要參數(shù)見(jiàn)表3。由表3可以看出，當(dāng)水溫升高時(shí)，吸收速率(ka)、分布速率(α)和消除速率(β)均較快，吸收半衰期[T1/2(ka)]、分布半衰期[T1/2(α)]和消除半衰期[T1/2(β)]均縮短。而且28 ℃條件下其達(dá)峰時(shí)間(Tpeak)和藥時(shí)曲線下面積(AUC)也低于18 ℃條件下。

Table3Pharmacokinetic parameters for ROBH following single oral administration of 20 mg·kg-1at 18 ℃ and 28 ℃

參數(shù)Parameters18 ℃28 ℃A/(μg·mL-1)4.177.69B/(μg·mL-1)2.480.13α/h-10.010.02β/h-10.0080.01ka/h-10.050.27T1/2(ka)/h14.672.54T1/2(α)/h64.6030.99T1/2(β)/h85.5258.63K21/h-10.0090.01K10/h-10.010.02K12/h-10.00020.0002Tpeak/h42.3610.03Cmax/(μg·mL-1)3.515.76AUC/(μg·mL-1·h)554.18326.74CL(s)/(L·h-1·kg-1)0.040.06 V/F(c)/(L·kg-1)3.792.78

A為分布相的零時(shí)截距；α為分布速率常數(shù)；B為消除相的零時(shí)截距；β為消除速率常數(shù)；ka為吸收速率常數(shù)；T1/2(α)為分布半衰期；T1/2(β)為消除半衰期；T1/2(ka)為吸收半衰期；Tpeak為達(dá)峰時(shí)間；Cmax為峰濃度；AUC為藥時(shí)曲線下面積；CL為腎清除率；V/F為相對(duì)表觀容積。

A，Zero intercept of distribution phase;α，Distribution rate constant;B，Zero intercept of phase elimination;β，Elimination rate constant;ka，Absorption rate constant;T1/2(α)，Distribution half-life;T1/2(β)，Elimination half-life;T1/2(ka)，Absorption half-life;Tpeak，Time at highest peak of concentration;Cmax，The biggest concentration of the drug in plasma; AUC，Area under concentration-time curve; CL，The overall clearance rate;V/F，Apparent volume of distribution.

3 討論

3.1 鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾血漿中的藥-時(shí)曲線特征

3.2 鹽酸氯苯胍在斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征