DNA條形碼在廈門灣魚卵和仔稚魚分類鑒定中的應(yīng)用

林君卓，吳 昊，陳 凱，杜慶紅，黃智偉，黃 昆，王鑫煌，陳 然，鄭連明

(1.福建海洋研究所，福建 廈門 361013； 2.福建省海陸界面生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

魚卵、仔稚魚的數(shù)量將直接影響到魚類補(bǔ)充群體資源量的豐歉，因此，魚卵、仔稚魚具有非常重要的生態(tài)地位和研究價值。但魚卵、仔稚魚的準(zhǔn)確鑒定是魚類浮游生物多樣性與生態(tài)學(xué)研究長期以來的瓶頸。我國已知海洋魚類已超過3000 種，約占世界海洋魚類種類的1/4，但是有資料可查的魚卵與仔稚魚種類不超過300 種[1]。作為種類甄別的形態(tài)特征較少，加上專業(yè)分類資料及人才的缺乏，使僅憑外部形態(tài)特征對魚卵、仔稚魚進(jìn)行精確分類變得相當(dāng)困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)以其操作簡便性和高效性的特點(diǎn)，已經(jīng)成為生物分類學(xué)中引人注目的新方向，越來越多的研究證明DNA條形碼是一個行之有效的生物種類鑒定手段[2]。全球共享的基因數(shù)據(jù)庫如DDBJ、ENBL、GenBank等所收藏魚類的各種基因及序列數(shù)量迅速增加，為魚卵、仔稚魚提供了大量可比對的成魚同源性DNA基因序列，研究者可以將DNA條形碼技術(shù)直接運(yùn)用到魚卵、仔稚魚的鑒別中，保證了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文以2017年4月廈門灣的魚卵、仔稚魚樣品為材料，采用形態(tài)學(xué)與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合的形式進(jìn)行種類鑒定，并確定其形態(tài)特征，探索DNA條形碼在魚卵、仔稚魚樣品種類鑒定中的應(yīng)用，旨在為魚卵、仔稚魚的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查海區(qū)及站位設(shè)置

2017年4月(春季)于廈門灣及其鄰近海域(118°01′～118°13′E，24°22′～24°35′N)進(jìn)行了魚類浮游生物調(diào)查。本次調(diào)查共設(shè)置9個站位，如圖1所示。

1.2 樣品采集與處理

魚類浮游生物海上采集根據(jù)《海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分：海洋生物調(diào)查》(GB/T 12763.6—2007)進(jìn)行。使用浮游生物淺水I型網(wǎng)(網(wǎng)口直徑50 cm，網(wǎng)長145 cm，網(wǎng)口面積0.2 m2，網(wǎng)衣篩絹孔徑0.505 mm)進(jìn)行垂直樣品采集，使用浮游生物海水大型網(wǎng)(網(wǎng)口直徑80 cm，網(wǎng)長280 cm，網(wǎng)口面積0.5 m2，網(wǎng)衣篩絹孔徑0.505 mm)以2 kn的船速進(jìn)行水平拖網(wǎng)10 min，采集表層樣品。所獲的網(wǎng)采樣品先保存于500 mL樣品瓶中，現(xiàn)場使用中性甲醛固定，加入量為樣品體積的5%，回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移到無水乙醇中避光保存。本研究僅分析各站位垂直拖網(wǎng)采集的定量樣品。

在實(shí)驗(yàn)室中于Zeless Stemi 2000-C立體顯微鏡下進(jìn)行魚類浮游生物的挑取和分離，參考各類魚類浮游生物的分類圖鑒[3-6]，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將魚卵、仔稚魚先進(jìn)行大致的分類并采集圖像，最后對挑選出的魚類浮游生物進(jìn)行分子鑒定。

1.3 分子鑒定實(shí)驗(yàn)方法

進(jìn)行基因組DNA提取的魚卵與仔、稚魚，體長較小的仔魚取整尾，較大的稚魚取尾部或者背部組織；魚卵則取整粒。使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0 試劑盒進(jìn)行DNA提取，使用Ward等[7]針對魚類設(shè)計的FishCOI引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×buff 5 μL，Dntp 0.8 μL，F(xiàn)ishF1與FishR1各0.5 μL，rTaq 0.3 μL，DNA 5.0 μL，滅菌超純水37.9 μL。

PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，72℃延伸5 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳(110 V，20 min)后，選取條帶明亮、無拖帶的樣品送往上海生工測序公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Chromos 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行檢測，對序列兩端堿基峰型不合格的部分進(jìn)行剪切，再將校正完畢的雙向序列用DNAMAN進(jìn)行拼接，保留序列長度在600～700 bp之間。獲取序列在GenBank數(shù)據(jù)庫、FISH-BOL數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性比較，根據(jù)比對的結(jié)果來初步確定樣品所屬的魚類種類或魚類類群。在GenBank中收集所比對出的魚類種類同屬、同種的COI序列，使用MEGA 5.1利用鄰近法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，基于Kimura-2-parameter 模型，采用N-J法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來對比對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，最終確認(rèn)魚卵與仔稚魚所屬的魚類種類或類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)種初選

本研究在廈門灣共采集到魚卵44粒，仔稚魚31尾；經(jīng)形態(tài)初步甄別，共分選出了5種形態(tài)的魚卵與5種形態(tài)的仔、稚魚。

2.2 測序結(jié)果

將經(jīng)形態(tài)初選的5種魚卵樣品30份，5種仔稚魚樣品10份分別作分子鑒定實(shí)驗(yàn)。由于部分樣未能成功提取基因組DNA，故無法擴(kuò)增得到COI基因序列，最終獲得27條COI基因序列，其中魚卵樣品獲得19條序列，仔稚魚樣品獲得8條序列。序列長度為580 bp。

2.3 序列比對

本研究采用將遺傳相似度>99%的序列視為同一種類、90%～98% 為同一屬、80%～89% 為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對廈門海域的魚卵、仔稚魚進(jìn)行種類判定。經(jīng)比對，實(shí)驗(yàn)所獲序列與GenBank和FISH-BOL上的魚類基因相似度為99%～100%，且兩庫鑒定結(jié)果一致，共鑒定出了7種魚卵與5種仔稚魚，其中魚卵樣品比形態(tài)學(xué)分類鑒別的種類數(shù)多出了2種；所有樣品經(jīng)分子鑒定，共計鑒定出11個種類，分別隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鱸形目(Perciformes)、鲉形目(Scorpaeniformes與鰈形目(Pleuronectiformes)(表2)；其中，隸屬于鱸形目的魚類浮游生物種類數(shù)量最多，有6種，占所有魚類種類的55%，其次為鲉形目有2種，占所有種類的18%。

2.4 基于COI基因序列構(gòu)建的N-J進(jìn)化樹

根據(jù)獲得序列在GenBank和FISH-BOL數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果，收集鯡形目的鯡科(Clupeidae)，鱸形目的鯧科(Stromateidae)、鯛科(Sparidae)、鲾科(Leiognathidae)、石首魚科(Sciaenidae)、擬魚叚虎魚科亞科(Gobionellinae)，鲉形目的毒鲉科(Synanceiidae)與鲬科(Platycephalidae)，鰈形目的鰨科(Soleidae)等同屬同源序列，選取合適的序列作為外群，利用鄰接法構(gòu)建NJ樹，如圖2所示?？梢钥闯?，各樣品序列與比對結(jié)果相似性最高的同源序列聚集成獨(dú)立分支，且在進(jìn)化樹上基本都與其他同源序列聚集成科分類階元分支，說明其分子鑒定結(jié)果的有效性。

2.5 形態(tài)描述

采集經(jīng)分子鑒定出的11種魚類浮游生物的高清形態(tài)圖(圖3)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，對其甄別性的形態(tài)特征進(jìn)行描述，詳見表3。

3 討論

3.1 DNA條形碼技術(shù)在魚類浮游生物鑒定中的適用性及局限性

早在2002年，Tautz等首先提出可以運(yùn)用DNA序列的方法來進(jìn)行物種鑒定和分類，隨后Hebert等[2]提出了基因條形碼的概念，同時指出線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因中的一個片段可以有效地鑒別物種，并認(rèn)為全球的生物均可進(jìn)行條形編碼。這項(xiàng)技術(shù)很快在形態(tài)學(xué)方法遭遇瓶頸的魚卵仔稚魚分類鑒定領(lǐng)域得到應(yīng)用。卞曉東等[8]采用mtCOI序列分析方法鑒定了在黃海海區(qū)海藻上采集到的魚卵，并最終確定為沙氏下鱵魚(Hyporhamphussajori)魚卵，而非魚卵形態(tài)相近、產(chǎn)卵時間、海域相同的太平洋頜針魚(Strongyluraanastomella)魚卵。Ko 等[9]采用DNA條形碼技術(shù)對臺灣100 種仔稚魚的分析中，將遺傳相似度>99%的兩個物種認(rèn)定為同一種，遺傳相似度在92%～99% 之間的為同一屬物種、遺傳相似度在84%～91%之間的為同一科物種。

表 2 11種魚類浮游生物的COI 基因信息

表3 魚類浮游生物形態(tài)描述

續(xù)表3

本研究采用將遺傳相似度>99%的序列視為同一種類、90%～98% 為同一屬、80%～89% 為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對廈門海域的魚卵、仔稚魚進(jìn)行種類判定。遵循以上標(biāo)準(zhǔn)，將本研究在廈門灣采集并獲得的魚卵、仔稚魚的DNA條形碼序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對后，所得分子結(jié)果比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果更高效、更準(zhǔn)確。如本研究根據(jù)DNA條形碼的鑒定結(jié)果，共鑒定出了7種魚卵與5種仔稚魚，全部鑒定到種，而形態(tài)學(xué)鑒別結(jié)果只有5種魚卵與5種仔稚魚，且只有5種仔稚魚能鑒定到種，魚卵依據(jù)形態(tài)特征僅能鑒定到屬或科水平。此外，本次研究中有部分魚卵還處于卵裂期，在形態(tài)方面，除了卵徑大小之外沒有其他可用于鑒定的特征，但是使用DNA條形碼技術(shù)卻能夠直接鑒定出種類，并且在處于同等大小的卵裂期魚卵中，鑒定出了銀鯧與日本鬼鲉2個種，在最初此2種魚卵被認(rèn)定是同一種。

將DNA條形碼技術(shù)運(yùn)用到魚類浮游生物的鑒定中，幫助解決了很多傳統(tǒng)分類無法解決的問題，在魚類分類學(xué)、漁業(yè)資源保護(hù)等方面都取得了不錯的成果，但該技術(shù)的應(yīng)用時間僅有短短的十?dāng)?shù)年，目前仍然存在著一些不足與需要解決的問題。GenBank是一個開放的共享數(shù)據(jù)庫，雖然擁有龐大的數(shù)據(jù)資料，但是其中的基因序列質(zhì)量卻良莠不齊，利用DNA條形碼技術(shù)雖然可以快速鑒別物種，但這項(xiàng)技術(shù)還是需要結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法才能獲得正確的種類序列，從而為DNA條形碼鑒別工作累積有效的資料。雖然使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法需要較高的專業(yè)水準(zhǔn)，并且具有局限性，但是只有以此為基礎(chǔ)，將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法與DNA條形碼技術(shù)這一全新的分類方法結(jié)合起來，才能進(jìn)一步對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行完善，才能更好地評估與保護(hù)魚類的多樣性。

3.2 廈門灣魚類浮游生物多樣性

廈門灣海域?qū)儆趤啛釒再|(zhì)的河口海灣，地形復(fù)雜，港闊水深，常年不凍，是一個條件十分優(yōu)越的天然海港。此海區(qū)初級生產(chǎn)力水平較高[10]，物種豐富多樣，同時是許多經(jīng)濟(jì)魚類的產(chǎn)卵場及育幼場[11]。江素菲等[12]根據(jù)1987年3月至1988年2月采集的樣品，并結(jié)合1983年4月至1984年3月在九龍江口采集的樣品進(jìn)行鑒定，得出共有魚卵14種，隸屬于4目7科11屬；仔稚魚49種，隸屬于9目29科47屬。林楠等[13]于2007年11月—2008年8月在九龍江口共鑒定出33種魚類浮游生物，隸屬于16屬15科。張躍平[14]于2007年8月至2009年10月期間在廈門海域共鑒定6種魚卵，其中斑魚祭(占總量的44.3%)和多鱗魚喜(占總量的20.2%)是主要優(yōu)勢種；仔稚魚共鑒定19種，主要優(yōu)勢種是康氏小公魚、多鱗魚喜和肩鰓鳚。徐春燕等[15]于2013 年4 月在廈門南部海域共鑒定魚卵和仔稚魚21 種，其中魚卵14 種，仔稚魚9 種，魚卵、仔稚魚數(shù)量主要以黃姑魚(Nibeaalbifora))、青鱗小沙丁魚(Sardinellazunasi)和魚叚虎魚科(Gobiidae sp.)為主。廈門海域魚資源豐富，但在有關(guān)魚卵、仔稚魚的調(diào)查研究中卻有很多種類都無法鑒定到種，甚至未能鑒定。例如，蔡秉及等[16]對廈門島區(qū)和大嶝島區(qū)海域進(jìn)行4 個航次的浮性魚卵和仔稚魚的種類組成與數(shù)量分布進(jìn)行報道，共記錄44種魚類，其中魚卵和仔、稚魚各28 種，但鑒定到種的分別為18 種和21 種。張躍平于2007年8月至2009年10月期間在廈門海域共鑒定22種魚類浮游生物，鑒定到種水平的僅11種[14]。

本研究采用DNA 條形碼技術(shù)并結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)甄別，對廈門海域采集到的魚卵、仔稚魚進(jìn)行種類鑒定，共獲得有效序列27條，完成的數(shù)據(jù)分析中，共鑒定種類11種。本研究結(jié)果報道的種類數(shù)較少，主要原因在于本次DNA條形碼測序樣品僅選取垂直拖網(wǎng)的定量樣品，如果能全面分析水平拖網(wǎng)樣品，相信能夠得到更豐富的多樣性結(jié)果；此外，本次采樣主要集中在環(huán)廈門島周邊，未往九龍江口方向延伸采樣，而據(jù)以往報道，九龍江口是魚類浮游生物多樣性較高區(qū)域[12-13]。在本次鑒定出的魚類浮游生物中，雖大部分種類在廈門灣的魚類資源調(diào)查中都有被報道過[16-19]，但之前的報道多見于仔、稚魚的樣品鑒定結(jié)果，而本研究中有7種魚卵經(jīng)過DNA條形碼技術(shù)分析，全部鑒定到種，并對其形態(tài)特征做了詳細(xì)的描述，有效地補(bǔ)充了廈門灣魚類浮游生物多樣性的研究資料。在未來可以擴(kuò)大采樣范圍，發(fā)現(xiàn)以往未能鑒定出的物種，更全面地反映廈門灣魚類浮游生物的多樣性。