溶劑萃取法脫除銀杏酸工藝研究

徐 京，吳元鋒,2，徐超奕，程 勇，管成林，姚慧敏

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023;2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 3100233.浙江天草生物科技股份有限公司，浙江 安吉 313300;4.杭州天草科技有限公司，杭州 310013)

銀杏葉提取物(ginko biloba extract，GBE)主要含有銀杏黃酮(如槲皮素、山奈酚、異鼠李素)、銀杏內(nèi)酯(A、B、C)等活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗炎癥、抗細胞凋亡、調(diào)節(jié)血脂、防治動脈粥樣硬化等作用，因此廣泛用于防治心腦血管疾病[1-3]。銀杏葉提取物中還含有銀杏酸，包括C13∶0(R=C13H27)、C15∶0(R=C15H31)、C15∶1(R=C15H29)、C17∶1(R=C17H33)、C17∶2(R=C17H31)等，這類化合物具有致敏性、胚胎毒性、細胞毒性、免疫毒性，因此銀杏葉提取物必須脫除銀杏酸[4]。德國限定GBE中銀杏酸含量應(yīng)在5 mg/kg以下，中國藥典也限定GBE中銀杏酸含量應(yīng)在10 mg/kg以下[5-7]。

目前已有多種銀杏酸脫除方法的報道。通過大孔吸附樹脂純化，能使銀杏酸的含量控制在5 ppm以下[8-9]。吳向陽[10]等研究了超臨界CO2脫除銀杏酸工藝，脫除率為79.1%。除此之外，還有發(fā)酵法[11-12]、中藥配伍減毒法[13]等也可以降低銀杏葉產(chǎn)品中的銀杏酸含量。為了獲得更好的脫除效果，本研究采用有機溶劑萃取法，在保留銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的情況下研究銀杏酸脫除工藝。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配有2424蒸發(fā)光散射檢測器和2998紫外檢測器，Thermo Biofuge Primo R高速冷凍離心機，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SB-5200DT數(shù)控超聲波清洗機，XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水鍋。

1.1.2 材料與試劑

原料：5種銀杏葉樣品于2017年3月購自山東、河南、河北、湖北及云南的中藥房，分別命名為YP1、YP2、YP3、YP4、YP5，用中草藥粉碎機將銀杏葉研磨成粉，干燥儲存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品：銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品(C13∶0、C17∶1)、銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(銀杏內(nèi)酯A、B、C)、銀杏黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(山奈酚標(biāo)、槲皮素標(biāo)、異鼠李素標(biāo))，均購自上海長哲生物科技有限公司。

主要試劑：磷酸、乙醇、磷酸氫二鈉、三氟乙酸等為分析純，甲醇和乙腈為色譜純，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀杏葉提取物制備

銀杏葉提取物按照文獻[14]方法制備：銀杏葉用中草藥粉碎機粉碎，稱取70 g粉末于圓底燒瓶中，加入500 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，回流提取2 h，抽濾，殘渣再用500 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液回流提取2 h。合并提取液，靜置24 h，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 最適pH條件

配制5份體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2、3、4、5和6。分別量取20 mL正己烷、20 mL不同pH值的乙醇溶液、2 mL銀杏提取濃縮液加入分液漏斗，振蕩萃取，待靜置分層后，將上下相分別蒸干，體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液定容至10 mL，分別用高效液相色譜測定上下相中的銀杏酸、銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮含量。

1.2.3 最適乙醇體積分?jǐn)?shù)

在最適pH條件下配制體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液，取20 mL正己烷、20 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液、2 mL銀杏提取濃縮液加入分液漏斗，萃取、濃縮后定容，分別用高效液相色譜測定上下相中的銀杏酸、銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮含量。

1.2.4 最適有機相

在最適pH條件和乙醇體積分?jǐn)?shù)下，以正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯分別作為有機相。取20 mL不同有機相，20 mL最適pH和體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液、2 mL銀杏提取濃縮液加入分液漏斗，萃取、濃縮后定容，分別用高效液相色譜測定上下相中的銀杏酸、銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮含量。

1.2.5 分析方法

本研究所用銀杏酸、銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮的分析均采用歐洲藥典方法[5]進行。

1.2.5.1 銀杏酸分析方法 色譜柱：WelchromC8(4.6 mm×250 mm，5 μm)反向色譜柱色譜柱，檢測器為2998紫外光檢測器。流速為1 mL/min，流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.01%三氟乙酸水溶液，流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.01%三氟乙酸乙腈溶液。梯度條件：0～30 min，25% A變化到10% A，維持5 min，1 min內(nèi)變化到25% A，維持9 min。柱溫25 ℃，上樣量50 μL，波長210 nm。

1.2.5.2 銀杏黃酮分析方法 色譜柱：WondaCract ODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)反向色譜柱檢測器，2998紫外光檢測器。流速1 mL/min，流動相A為0.3 g/L磷酸水溶液，流動相B為甲醇。梯度條件：0～1 min，60%A；1～20 min，A從60%變化到45%；20～21 min，A從45%變化到0%，維持4 min。

表1 銀杏內(nèi)酯液相分析洗脫梯度Table 1 Elution gradient ofginkgolidesanalyzed by HPLC

柱溫25 ℃，上樣量10 μL，波長370 nm。

1.2.5.3 銀杏內(nèi)酯分析方法 色譜柱：WondaCract ODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)反向色譜柱，2424蒸發(fā)光散射檢測器，流速1 mL/min，流動相A為甲醇，流動相B為水，柱溫25 ℃，上樣量10 μL，增益500，氣體壓力40 psi(2.76×105Pa)，動力級別10，漂移管溫度70 ℃。梯度條件見表1。

1.2.5.4 分配比計算 上相和下相分別定容到10 mL后，用液相法測定上相和下相中銀杏內(nèi)脂、銀杏黃酮和銀杏酸的質(zhì)量濃度(mg/mL)。銀杏內(nèi)酯為銀杏內(nèi)酯A、B和C含量的總和；銀杏黃酮為槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的總和；銀杏酸為銀杏酸A和銀杏酸B含量的總和。兩相的分配比按照下列公式計算：

分配比=水相中各活性成分質(zhì)量濃度(mg/mL)/有機相中各活性成分質(zhì)量濃度(mg/mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀杏內(nèi)酯、銀杏黃酮和銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.2.5分析方法，配制系列濃度的銀杏內(nèi)酯、銀杏黃酮和銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)液，HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 銀杏內(nèi)酯、銀杏黃酮和銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of ginkgolides, ginkgo flavones and ginkgolic acids

圖1 5種銀杏葉樣品銀杏酸含量Fig.1 Ginkgolic acid contents in 5species of ginkgo sample leaves

2.2 不同產(chǎn)地銀杏葉中活性物含量對比

通過HPLC法測定了不同產(chǎn)地銀杏酸含量，結(jié)果如圖1所示，表明銀杏葉中總銀杏酸含量具有一定的區(qū)域性，該結(jié)果與文獻[15]報道一致。為了研究脫酸效果，本研究采用銀杏酸含量最高的產(chǎn)自云南的銀杏葉YP5為原料開展研究。經(jīng)過溶劑萃取、干燥后得到銀杏葉提取物，銀杏酸含量為1.78 mg/g，其含量遠超中國藥典要求。

2.3 水相pH值對分配比的影響

正己烷為有機相，60%乙醇為水相，水相pH值分別為2、3、4、5和6時，銀杏葉提取物中各物質(zhì)的上下相分配比如圖2所示。

從圖2中可知，水相pH值對銀杏葉提取物中各成分的分配比有較大的影響。銀杏黃酮幾乎不溶于正己烷，全部分配于下相。銀杏內(nèi)酯也主要分配于下相，pH值越低，在下相分配越多。而銀杏酸卻剛好相反。當(dāng)pH值為6時，大部分銀杏酸也分配在下相，當(dāng)pH值為2時，分配比最少，表明在此pH值下，銀杏酸更多地分配在上相。由此可知，pH值為2時，銀杏酸的脫除效果最好。

圖2 水相pH值對銀杏內(nèi)酯和銀杏酸分配比的影響Fig.2 Effects of pH value of aqueous phase on partition ratios of ginkgolide and ginkgolic acid

2.4 水相乙醇體積分?jǐn)?shù)對分配比的影響

正己烷為有機相，水相pH值為2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%和80%時，銀杏葉提取物中各物質(zhì)的上下相分配比如圖3所示。

圖3 水相乙醇體積分?jǐn)?shù)對銀杏內(nèi)酯和銀杏酸分配比的影響Fig.3 Effects of ethanol volume fraction of aqueous phase on partition ratios of ginkgolide and ginkgolic acid

在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下，銀杏黃酮全部分配在下相。由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對銀杏內(nèi)酯的分配也有一定的影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，分配比越低，表明在乙醇含量較低時銀杏內(nèi)酯在下相的分配比越高。乙醇體積分?jǐn)?shù)對銀杏酸的影響較為復(fù)雜，在純水、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%和80%時，分配比較高，而在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，分配比最低，表明在該乙醇濃度下最適合脫除銀杏酸。

2.5 有機相對分配比的影響

水相pH值為2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，分別以正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯為有機相，銀杏葉提取物中各物質(zhì)的上下相分配比如圖4所示。

從圖4可知，以正己烷為有機相時，銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯都集中在水相，銀杏酸則分配在有機相，表明正己烷為有機相時，脫除效果更好。然而用其他有機溶劑為有機相時，銀杏黃酮在兩相均有分布。二氯甲烷或三氯甲烷為有機相時，銀杏內(nèi)酯分配比較高，表明銀杏內(nèi)酯也基本分配在水相。從脫酸效果來看，正己烷和二氯甲烷的脫酸效果較好，但是二氯甲烷脫酸時銀杏黃酮也有損耗，綜上所述，正己烷為最適脫酸溶劑。

圖4 有機相成分對銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和銀杏酸分配比的影響Fig.4 Effects of organic phase composition on partition ratios of ginkgo flavone, ginkgolide and ginkgolic acid

3 結(jié) 論

本文研究了脫除銀杏酸的最佳萃取體系，結(jié)果表明：當(dāng)下相為pH值2.0、體積分?jǐn)?shù)40%乙醇，上相為正己烷時，脫酸效果最好。若結(jié)合樹脂吸附等脫酸技術(shù)，則有望進一步降低提取物中銀杏酸含量。