老年根齲患者唾液菌群多樣性初步分析

楊會(huì)肖 呂胡玲 陳慧姍 吳紅崑

根齲是老年人群中常見(jiàn)的口腔疾患，據(jù)第三次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)65～74歲的老年人群中根齲的患病率高達(dá)63.6%[1]。根齲進(jìn)展迅速，治療不及時(shí)常常會(huì)累及牙髓或根尖周組織，造成疼痛，甚至失牙，嚴(yán)重危害老年人的口腔及全身健康，降低生活質(zhì)量[2]。目前公認(rèn)的齲病致病機(jī)制為口腔菌群失衡學(xué)說(shuō)[3-4]，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為：某些口腔微生物產(chǎn)酸引起牙面環(huán)境酸化，口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，產(chǎn)酸或耐酸菌的定植增加，引起牙齒表面脫礦與再礦化過(guò)程發(fā)生失衡，導(dǎo)致牙體硬組織崩解和牙本質(zhì)的有機(jī)基質(zhì)暴露；同時(shí)，酸環(huán)境還可以活化機(jī)體內(nèi)的蛋白酶導(dǎo)致暴露的牙本質(zhì)基質(zhì)不斷發(fā)生降解?？谇晃⑸锞旱南嗷プ饔霉餐龠M(jìn)了齲病的發(fā)生及發(fā)展。

目前，已知人類口腔中存在的細(xì)菌約700種[5]，其中超過(guò)一半是用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法培養(yǎng)的。Preza等[6]利用克隆測(cè)序的方法對(duì)根齲牙菌斑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，除了變異鏈球菌、乳酸桿菌及放線菌外，糞腸球菌、阿托波菌、歐陸森氏菌、擬溶半乳桿菌、Pseudoramibacter alactolyticus，以及丙酸桿菌屬和月形單胞菌屬的個(gè)別細(xì)菌株均與根齲的發(fā)生密切相關(guān)，揭示了根齲相關(guān)細(xì)菌的復(fù)雜性和多樣性；但其他研究卻得出了不同的結(jié)論[7-8]，因此，有必要對(duì)根齲相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

唾液是口腔內(nèi)細(xì)菌的天然載體，是形成牙菌斑的外部環(huán)境。已有的研究表明，唾液中微生物的種類決定了牙面上菌群的定植模式[9]，罹患牙周病或齲病的人群，其唾液微生物群落與健康人存在顯著差異[10]；同時(shí)唾液微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，唾液取樣簡(jiǎn)單，無(wú)痛，具有無(wú)創(chuàng)性，因此，常常被用于口腔微生物多樣性的研究[11]。但目前這些研究多集中于兒童或中年人，且主要針對(duì)冠部齲，目前，尚未見(jiàn)到有關(guān)根齲與唾液微生物群落組成關(guān)系的研究。

區(qū)別于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的高通量方法如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，可以不必對(duì)原始樣本進(jìn)行培養(yǎng)而直接提取基因組DNA，分析細(xì)菌群體在基因水平和代謝水平上的多樣性，監(jiān)測(cè)微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，以及發(fā)現(xiàn)新的口腔微生物物種等[12]。本研究采用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)初步探討不同根齲狀況的老年人唾液微生物群落的多樣性變化，尋找根齲相關(guān)優(yōu)勢(shì)菌群，期望為老年人根齲的預(yù)測(cè)及防治提供一定理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1臨床材料 隨機(jī)抽樣總體為參加2012年5月～2013年7月度四川大學(xué)華西醫(yī)院全身體格檢查的65歲以上老年人，年齡65～92歲。實(shí)驗(yàn)分為2組：根齲組：根齲牙面數(shù)(Root caries surface,RDS)≥1，n=10；健康對(duì)照組：n=10。根齲的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]為：齲損質(zhì)軟或皮革感，齲損位于根面上或釉牙本質(zhì)界處但大部分位于根面上，包括原發(fā)齲和繼發(fā)齲?？偧{入標(biāo)準(zhǔn)：全身健康狀況良好，精神狀況正常，無(wú)長(zhǎng)期服藥史，未罹患糖尿病、高血壓、舍格倫綜合癥等系統(tǒng)性疾病，未接受頭頸部術(shù)后放化療等，采樣前2個(gè)月未服用抗生素，抗菌漱口液及免疫抑制劑，口腔衛(wèi)生較好，牙齦健康，除根齲外，無(wú)其他明顯口腔感染性疾病如牙周病、牙髓炎、口腔黏膜疾病及腫瘤等，剩余牙數(shù)大于18顆，無(wú)長(zhǎng)烤瓷橋修復(fù)。

1.2樣本采集 經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象或其監(jiān)護(hù)人在取樣前均簽署知情同意書(shū)。由同一名操作者于上午8時(shí)左右分別收集2組人群非刺激性全唾液2～3mL，取樣前均禁水禁食，自然口含唾液數(shù)分鐘后讓唾液自行流入無(wú)菌EP管中，-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA的提取和PCR擴(kuò)增 將唾液樣本在室溫下化凍，離心，收集細(xì)菌沉淀。使用Master PureTMDNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies公司，美國(guó))提取唾液樣本中細(xì)菌全基因DNA作為模板。選用通用引物Bac1和Bac2對(duì)細(xì)菌的16Sr RNA基因V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，其中Bac1引物5′端連接40bp的“GC夾”，序列如下。Bac1:5′-CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCG CCC GAC TAC GTC CCA GCA GCC-3′，Bac2:5′-GGA CTA CCA GGGTAT CTA ATCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為300bp。2%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4變性梯度凝膠電泳 (DGGE)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)DCodeTMUniversal Mutation檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行變性梯度凝膠電泳[12]。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%(w/v)，變性劑濃度梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～70%。電壓恒定條件下，在1×TAE緩沖液(pH 8.5)中電泳16h。電泳完成后，溴化乙錠的染色，后于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))采集DGGE凝膠的數(shù)碼圖像。

1.5 DGGE凝膠圖像分析 采用Quantity One1-D分析軟件4.6.2(Bio-Rad公司，美國(guó))對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析。DGGE圖譜進(jìn)行優(yōu)化處理后，識(shí)別、調(diào)整泳道及條帶，進(jìn)行條帶配對(duì)，并對(duì)圖譜中的條帶進(jìn)行半定量分析，采用豐富度(S)和Shannon-Wieners指數(shù)(H’)反應(yīng)群落的多樣性。使用非加權(quán)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6切膠回收及序列測(cè)定 選擇特征性條帶進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物以Bac1/Bac2通用引物進(jìn)行再富集，擴(kuò)增產(chǎn)物送大連TaKaRa生物公司進(jìn)行克隆、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果于人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)(HOMD，http://www.homd.org)，美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI，http://ncbi.nlm.nih.gov)和RDPⅡ數(shù)據(jù)庫(kù)(Ribosomal database project，http://rdp.cme.msu.edu)中進(jìn)行BLAST檢索比較，一致性達(dá)到98%-100%的序列被認(rèn)為具有陽(yáng)性指示意義。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間豐富度(S)及Shannon-Wieners指數(shù)(H’)差異，顯著性水檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P＜ 0.05。

2.結(jié)果

2.1 DGGE圖譜總體特征 根齲與無(wú)齲組老年人群唾液微生物群落的DGGE圖譜見(jiàn)圖1，每個(gè)電泳條帶代表1個(gè)樣本，同一位置水平的條帶代表1種細(xì)菌的基因型。實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性，Sorensons相似系數(shù)為0.87。兩組人群唾液細(xì)菌的組成具有多樣性和個(gè)體差異性，圖譜表現(xiàn)為未見(jiàn)到完全相同的泳道出現(xiàn)。

圖1 唾液菌群的PCR-DGGE圖譜

3.2條帶類型分析 共發(fā)現(xiàn)34個(gè)不同類型的條帶(圖2，Band type1-34)，各泳道條帶數(shù)介于16～28之間，平均條帶數(shù)為19.85±2.56。其中有9個(gè)條帶(Band type 1,3,13,16,20,21,22,23,24)在約80%以上樣品中都有出現(xiàn)，其中Band type3,13,16,21的檢出率為100%，推測(cè)它們可能是老年人群口腔常駐菌群；6個(gè)條帶在兩組的分布有顯著差異，其中band type 5,27,32在健康組的絕大多數(shù)樣本里均能檢出(檢出率，5(90%)，27(90%)，32(80%))，而在根齲組檢出減少(檢出率，5(50%)，27(40%)，32(40%))。Band type 25在根齲組的檢出率為100%，在健康組僅檢出2例(檢出率，20%);而band14，34在根齲檢出率均達(dá)到80%，在健康組的檢出頻率則下降至30%，甚至更低(檢出率，14(30%)，34(20%))。這6個(gè)條帶分別對(duì)應(yīng)圖1中A,B,C,E,D,F,切膠回收后進(jìn)行克隆測(cè)序。

圖2 條帶類型分析圖

2.3多樣性分析 采用豐富度(S)和Shannon-Weaver指數(shù)(H’)來(lái)分析2組人群的多樣性。物種豐富度(species richness,S)是指群落所包含的物種數(shù)目，表明群落或微生態(tài)環(huán)境中物種數(shù)目的多寡[14]。本實(shí)驗(yàn)中豐富度以泳道中所有條帶數(shù)目表示。H’的計(jì)算是基于DGGE凝膠條帶的位置和條帶的強(qiáng)度(圖3)，計(jì)算公式為H′=∑piln(pi),(pi=ni/N)，其中ni為單個(gè)條帶的光密度，N為所有條帶的光密度[14]。老年無(wú)齲組唾液細(xì)菌的豐富度SNRC為20.90±2.92，而根齲組老年人唾液細(xì)菌的平均條帶數(shù)SRC為18.80±1.69，但兩組豐富度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(SNRC：SRC，P=0.103)；根齲組和無(wú)齲組老年人唾液菌群的Shannon-Wieners指數(shù)(H’)則分別為2.52±0.17和2.73±0.1，兩者之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 DGGE圖譜各條帶相對(duì)強(qiáng)度的數(shù)字化示意圖

3.4 UPGMA分析 UPGMA聚類分析結(jié)果(圖4)表明，除泳道16和19外，健康組內(nèi)大部分樣本(泳道 18，14，12，20，11，15，17，13)聚類到鄰近位置，Dice’s相似系數(shù)為0.61；而根齲組除了泳道1和7外，大部分樣本，(泳道2-6，8，9，10)亦聚類到鄰近的不同位置，兩組人群唾液微生物群落結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出較高內(nèi)部相似性。

圖4 UPGAM系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.5條帶回切測(cè)序結(jié)果 A-F每個(gè)條帶選取2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到了種屬、甚至株級(jí)別的微生物信息，測(cè)序匹配度高達(dá)98%以上(表1)。異發(fā)酵乳桿菌DSM5705(Lactobacillusmalefermentans strain DSM 5705)、未獲培養(yǎng)的真細(xì)菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(Uncultured Eubacterium sp clone IS017B74/IS013B55)及頰纖毛菌C-1013-b(Leptotrichia buccalis C-1013-b)在根齲組檢出率高于正常組；而副流感嗜血桿菌T3T1(Haemophilus parainfluenzae T3T1),奈瑟菌屬11-26360(Neisseria sp.11-26360)和某種未獲培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium clone ncd2240d01c1)在正常組檢出較頻率更高。

表1 回切條帶測(cè)序比對(duì)結(jié)果

3.討論

根面齲是老年口腔疾患中最常見(jiàn)、危害較大的疾病之一，它具有廣泛的流行性，臨床損害的特殊性及防治的復(fù)雜性，需要特別注意。口腔微生物菌群與宿主的相互作用同口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，以群落和微生物生態(tài)為基礎(chǔ)對(duì)口腔微生物菌群進(jìn)行探討不僅為理解根齲的病因?qū)W提供了新的視角，也為根齲的防治提供了新的手段。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)根齲及口腔健康老年人唾液微生物群落進(jìn)行總體分析，DGGE指紋圖譜共獲得34種不同位置的條帶，直觀地顯示了不同個(gè)體唾液微生物的組成具有多樣性及差異性。DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，老年根齲組的口腔微生物豐富度較老年健康組有減少的趨勢(shì)(組SRC=18.80±2.94；SNRC=20.90±2.51)，但差異不明顯；而老年根齲患者唾液菌群的另一多樣性指數(shù)-Shannon-Wieners指數(shù)(H’)(H’RC=2.52±0.17；H’NRC=2.73±0.18)則顯著小于正常者。因?yàn)镾hannon指數(shù)除了包括種數(shù)外，還包括各種間個(gè)體分配的均勻性(equability或evenness)。各種之間，個(gè)體分配越均勻，H’值就越大。如果每一個(gè)體都屬于不同的種，多樣性指數(shù)就最大；如果每一個(gè)體都屬于同一種，則其多樣性指數(shù)就最小，因此與豐富度的簡(jiǎn)便直觀相比，Shannon指數(shù)更能真實(shí)地反映多樣性，因此，我們認(rèn)為老年根齲患者唾液微生物菌落多樣性減少。根齲組唾液細(xì)菌的多樣性較正常組有減少的趨勢(shì)，這與Li等[15]的研究結(jié)果一致。而條帶類型分析則發(fā)現(xiàn)，6個(gè)條帶(band type 5,27,32,25,14,34)在兩組人群唾液中均可檢出，但檢出頻率差異較大。這些發(fā)現(xiàn)都再次驗(yàn)證了齲病的口腔菌群生態(tài)失衡學(xué)說(shuō)，即齲病的發(fā)生并不是由于某種致病菌的出現(xiàn)或者整個(gè)口腔微生物數(shù)量增多導(dǎo)致，而是隨著口腔微生態(tài)環(huán)境的改變，導(dǎo)致一部分細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖被抑制，數(shù)量減少或消失，而另一部分細(xì)菌則大量繁殖，轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件致病菌，從而導(dǎo)致齲齒的發(fā)生[16]。

結(jié)合特征條帶測(cè)序結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，頰纖毛菌C-1013-b(band type25)可以在老年根齲組唾液樣本中100%被檢出，這與Ling等[17]針對(duì)兒童齲病患者唾液菌群的研究一致。已知頰纖毛菌可以與韋榮菌及變鏈菌發(fā)生共聚，作為它們黏附于牙面的支架[18]。但Preza等則發(fā)現(xiàn)在健康根面菌斑中纖毛菌的檢出比例更高[11]。但頰纖毛菌C-1013-b是可以培養(yǎng)的，因此使得對(duì)它的理化性能及其與根齲的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步探討成為可能。已知真細(xì)菌包含較多種類，有學(xué)者指出Eubacterium saburreum可以與Veillonella spp.發(fā)生共聚幫助其黏附到牙面上導(dǎo)致齲病的發(fā)生[19]，但也有研究指出Eubactrium.saburreum clone GT038，Eubacterium sp.clone EI074，Eubacterium sp.clone DO016等與口腔健康密切相關(guān)[20]，提示我們不同的細(xì)菌株可能具有完全不同的生物特性，因此，有必要從基因型水平對(duì)微生物的毒力因子進(jìn)行探討。本研究發(fā)現(xiàn)，某種未獲培養(yǎng)的真細(xì)菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(band type 34)在根齲組樣本中的檢出率高于健康人群，這與Preza等所得出的結(jié)論一致[11]，同時(shí)這些種屬級(jí)別，甚至株級(jí)別微生物信息的獲得，也證實(shí)了DGGE在研究微生物多樣性方面的實(shí)用性。另外，本研究首次發(fā)現(xiàn)了唾液中異發(fā)酵乳桿菌DSM 5705(band type 14)在根齲組唾液中的檢出率亦遠(yuǎn)高于健康組。異發(fā)酵乳桿菌可以代謝葡萄糖等生成乳酸，且產(chǎn)酸能力較發(fā)酵乳桿菌更強(qiáng)[21]，其最適pH值范圍為4.1-6.9，但目前其與根齲發(fā)生的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。除此之外，本試驗(yàn)也證實(shí)了副流感嗜血桿菌T3T1(band type5)和奈瑟菌sp.11-26360(band type 32)與健康的口腔狀況關(guān)系密切[21,8,10]。由于唾液微生物菌群結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性及唾液取樣無(wú)創(chuàng)方便的優(yōu)勢(shì)，因此唾液微生物常常被作為口腔疾病檢測(cè)的分子生物學(xué)標(biāo)記。本文發(fā)現(xiàn)有6個(gè)菌株在兩組人群中的分布存在明顯差異，或許可以為根齲的唾液檢測(cè)提供一定的理論依據(jù)。

根據(jù)聚類分析的結(jié)果，我們無(wú)法將根齲及健康老年人唾液微生物分成2個(gè)截然不同的群落，可能與本研究樣本量有關(guān)，或例外樣品的存在有關(guān)。由于宿主的選擇作用，唾液微生物群落本身就具有個(gè)體獨(dú)特性[22]。但是，本文發(fā)現(xiàn)健康老年人唾液微生物相似性(Dicer系數(shù)為0.61)高于根齲組，提示可能有穩(wěn)定的唾液微生物菌群存在，它們對(duì)于維持老年人口腔健康十分重要。因此老年人應(yīng)定期進(jìn)行口腔檢查及口腔衛(wèi)生保健，維護(hù)良好的口腔生態(tài)平衡，保持口腔健康。