miR—let—7b通過調(diào)控相關(guān)細(xì)胞周期蛋白影響皮膚黑色素瘤的增殖和凋亡

秦琴 寧花蘭 陳小燕

[摘要]目的：探討miR-let-7b通過調(diào)控相關(guān)細(xì)胞周期蛋白影響皮膚黑色素瘤的增殖和凋亡。方法：qPCR法檢測miR-let-7b在黑色素瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況；雙熒光素酶報告基因檢測miR-let-7b與CCND1之間的相互作用；MTT增殖實驗檢測抑制miR-let-7b后黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力的變化情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制miR-let-7b后黑色素瘤細(xì)胞的凋亡行為的變化情況。結(jié)果：與癌旁正常皮膚組織相比，黑色素瘤組織中miR-let-7b的表達(dá)水平相對上調(diào)，與其他黑色素瘤細(xì)胞株相比，A375細(xì)胞中miR-let-7b表達(dá)最高；雙熒光素酶實驗證實miR-let-7b能與CCND1的3UTR特異性結(jié)合，可以調(diào)控CCND1的表達(dá)與活性；抑制miR-let-7b的表達(dá)后可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力；同時可以促進黑色素瘤細(xì)胞的凋亡行為。結(jié)論：miR-let-7b可以調(diào)控CCND1的表達(dá)從而影響黑色素瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

[關(guān)鍵詞]miR-let-7b；黑色素瘤；CCND1；凋亡；增殖

[中圖分類號]R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）07-0079-04

Abstract： Objective To investigate the effect of miR-let-7b on the proliferation and apoptosis of melanoma by regulating related cell cycle proteins. Methods Expression of miR-let-7b in melanoma tissues and cell lines was detected by qPCR. Double luciferase reporter gene was used to detect the interaction between miR-let-7b and CCND1. MTT proliferation assay was used to detect the proliferation of melanoma cells after inhibition of miR-let-7b. Flow cytometry was used to detect the apoptotic behavior of melanoma cells after inhibition of miR-let-7b. Results Compared with adjacent normal skin tissue， the expression level of miR-let-7b in melanoma tissue was relatively up-regulated. Compared with other melanoma cell lines， the expression of miR-let-7b was the highest in A375 cells. Double luciferase assay confirmed that miR-let-7b could specifically bind to the 3' UTR of CCND1 and regulate the expression and activity of CCND1. miR-let-7b can inhibit the proliferation of melanoma cells， And can promote the apoptosis of melanoma cells. Conclusion miR-let-7b can regulate the expression of CCND1 and affect the proliferation and apoptosis of melanoma cells.

Key words： miR-let-7b； melanoma； CCND1； apoptosis； proliferation

皮膚黑色素瘤是一種以侵襲性轉(zhuǎn)移生長和預(yù)后不良為特征的皮膚惡性腫瘤[1]。黑色素瘤的發(fā)病率一直居高不下，且晚期患者的死亡率較高[2-3]。轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的中位生存時間為6個月，5年生存率低于5%[4]。遺傳因素和過多的紫外線照射是黑色素瘤的主要危險因素[5]。研究探討黑色素瘤的分子生物學(xué)發(fā)病機制有助于提高其臨床診斷率和治療情況。微小RNA是在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類小型非編碼RNA，長度約為22～26個核苷酸[6]。miRNA通過不完全的堿基配對來調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程，抑制非翻譯區(qū)（3'-UTR）的結(jié)合進而影響mRNA表達(dá)穩(wěn)定性[7]。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，從核苷酸3'到5'端的核苷酸種子序列稱為miRNA末端靶標(biāo)，miRNA末端靶標(biāo)通常在3'端具有相應(yīng)的種子結(jié)合位點，然而單個miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個基因的表達(dá)，分子靶標(biāo)之間的識別系統(tǒng)變得尤為重要[8]。重要的是，miRNA靶位點通常在許多物種的基因組中進化保守，這表明miRNA和蛋白的相互作用在生物學(xué)功能和行為上具有重要意義。最近的研究表明多種miRNA的表達(dá)失調(diào)在人類惡性腫瘤的發(fā)展過程中起重要作用，而且根據(jù)特異性miRNA和腫瘤類型，miRNA可以作為腫瘤抑制因子或致癌基因，具有明顯的組織特異性[8]。但是在黑色素瘤中的具體作用方式尚未闡述清楚。本研究，首先檢測了miR-let-7b在黑色素瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測其對黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡行為的影響，明確細(xì)胞周期蛋白CCND1和miR-let-7b之間相互關(guān)系，為miRNA在黑色素瘤中的作用機制提供一定的理論支持。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源：收集2016年7月-2017年1月在筆者醫(yī)院行手術(shù)切除且經(jīng)病理檢查確診為皮膚黑色素瘤的組織60例，同時取癌旁正常皮膚組織60例。離體后放入4%多聚甲醛中固定。全部患者術(shù)后病理分期均經(jīng)2名副高以上病理科醫(yī)師共同閱片確定，所有患者術(shù)前無化療或放療，黑色素瘤組織為原發(fā)病灶并經(jīng)病理科證實，均自愿簽署知情同意書。將60例黑色素瘤組織和相應(yīng)配對的癌旁正常皮膚組織進行隨機分組，分為5組，分別是S1，S2，S3，S4，S5，檢測隨機分組后腫瘤組織和癌旁正常組織中miR-let-7b的表達(dá)情況。

1.2 細(xì)胞株與主要試劑：人黑色素瘤M21，A375，B16，B78H1和Malme-3M細(xì)胞株均購買于復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞庫（在37℃，5% CO2條件下，含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)）。胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。MALAT1，miR-20a及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于日本TAKARA公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSQ-101）購自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購自美國Sigma公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成。

1.3 qPCR實驗：使用miRNA提取試劑盒進行mRNA抽提，實驗過程按照試劑盒使用說明進行，抽提之后，使用核酸濃度檢測儀檢測RNA濃度和純度，最后將其濃度稀釋至50μg/ml，使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物進行cDNA合成，反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒使用說明進行設(shè)置。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min、95℃變性15s、60℃退火32s，循環(huán)50次后檢測其溶解曲線，檢測完成后，通過計算機系統(tǒng)自動分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達(dá)量。實驗分為NC組和MALAT1-siRNA組，分別轉(zhuǎn)染對照慢病毒和MALAT1-siRNA慢病毒。實驗重復(fù)3次。miR-let-7b引物序列：5'-CGTTGTGTAGTCGATGCTAGGTCCA-3'（正向）和5'-ATTTCGCGTAGTGTAGGGGCTATAT-3（反向）。CCND1引物序列：5'-ATTTCGGGCTTTTATTTGGATCGAT-3'（正向）和5'-TTCGGGAGGTGCTGGAATGC-3（反向）。

1.4 雙熒光素酶實驗：從人類基因組DNA產(chǎn)生全長miR-20a-3UTR，并通過退火合成的信號寡核苷酸產(chǎn)生突變體miR-let-7b-3UTR。miR-let-7b-3UTR WT代表野生型質(zhì)粒載體和質(zhì)粒結(jié)合共轉(zhuǎn)染到293U細(xì)胞內(nèi)，miR-let-7b-3UTR MUT代表突變型質(zhì)粒載體和質(zhì)粒結(jié)合共轉(zhuǎn)染到293U細(xì)胞內(nèi)，同時使用pGL-3.0（熒光素酶）作為內(nèi)參照，檢測NC組和MALAT1-siRNA組293U細(xì)胞中miR-let-7b的熒光活性相對值。使用Lipofectamine 2 000TM（Invitrogen）檢測轉(zhuǎn)染效率在孢菌素酶活性的基礎(chǔ)上正?；?。根據(jù)制造商的說明書，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒（Promega）測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，通過雙熒光素酶檢測miR-let-7b對CCND1的表達(dá)活性的調(diào)控能力，明確miR-let-7b對CCND1熒光活性的調(diào)控情況。

1.5 MTT細(xì)胞增殖實驗：將黑色素瘤A375細(xì)胞消化離心重懸，分為轉(zhuǎn)染細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，使用96孔板，設(shè)置3個復(fù)孔，每空加入2×103細(xì)胞，在37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)7d，每天分別按每100μl 培養(yǎng)基加入10μl CCK-8 液體，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，用酶標(biāo)儀在450nm下檢測各孔吸光值。以時間為橫軸，以每個時間點各組細(xì)胞的吸光值比率為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗：將不同組的黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)24h，然后用PBS洗滌3次。將1μM濃度的Hoechst染料加入各組中，20min染色，再用PBS洗滌3次，并在激光掃描共焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核型。將不同組的黑色素瘤細(xì)胞以2×106的密度接種在6孔板中，生長24h，加入100μl細(xì)胞懸液5μl Annexin V-FITC和10μl PI，并將細(xì)胞在黑暗中孵育30min。將PI（5μl，濃度為10μg/ml）加入細(xì)胞，在黑暗中再次孵育10min。通過流式細(xì)胞儀評估細(xì)胞識別細(xì)胞周期變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-let-7b在黑色素瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況：qPCR實驗結(jié)果表明，5組黑色素瘤細(xì)胞株樣本中，與其相鄰的正常皮膚組織相比，miR-let-7b在黑色素瘤組織中均明顯上調(diào)[（0.87±0.18）、（0.48±0.11）、（1.58±0.25）、（0.52±0.12）、（0.55±0.15）vs（0.10±0.00）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。不同黑色素瘤細(xì)胞株（M21，A375，B16，B78H1和Malme-3M）中檢測miR-let-7b的表達(dá)情況，A375細(xì)胞中表達(dá)水平相對最高[（1.32±0.28）vs（1.39±0.27）vs（0.88±0.14）vs（0.32±0.08）vs（0.35±0.10）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。后續(xù)實驗選取A375作為功能學(xué)實驗的細(xì)胞株。

2.2 miR-let-7b與細(xì)胞周期蛋白的相互調(diào)控關(guān)系：本實驗通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測與miR-let-7b具有互補堿基配對的蛋白分子，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白CCND1的3UTR的序列與miR-let-7b結(jié)合位點相似（見圖3）。通過雙熒光素酶實驗驗證miR-let-7b和CCND1之間的相互關(guān)系，探索miR-let-7b對CCND1的分子調(diào)控機制。結(jié)果顯示，抑制miR-let-7b的表達(dá)后可以下調(diào)野生型CCND1的3UTR的轉(zhuǎn)錄活性，而對于突變型CCND1則無明顯的調(diào)控作用（見圖4）。表明miR-let-7b可以直接調(diào)控CCND1的表達(dá)活性，影響其表達(dá)水平。

2.3 miR-let-7d在對黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響：通過克隆形成實驗檢測miR-let-7b對黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果如圖5～6所示，與NC組細(xì)胞相比，在miR-let-7b-inhibitor組A375細(xì)胞的增殖情況受到明顯的抑制[（0.98±0.08）vs（0.31±0.11）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表明抑制miR-let-7b的表達(dá)后，黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖能力受到相應(yīng)的抑制。

2.4 miR-let-7d在對黑色素瘤細(xì)胞凋亡行為的影響：通過流式細(xì)胞術(shù)實驗進一步檢查miR-let-7b對A375細(xì)胞凋亡行為的影響，實驗結(jié)果顯示（見圖7～8），與NC組相比，miR-let-7b-inhibitor組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯升高[（39.6±7.2）% vs（1.0±0.4）%，P<0.05]，G1期細(xì)胞周期進程明顯停滯[（83.2±6.8）% vs（61.2±5.1）%，P<0.05]。表明抑制miR-let-7b的表達(dá)后可以促進黑色素瘤A375細(xì)胞的凋亡行為，加速其凋亡。

3 討論

人皮膚黑色素瘤是黑色素惡性腫瘤中較常見的類型，相比其他部位的黑色素瘤類型發(fā)病率較高，且皮膚黑色素瘤患者的預(yù)后較差，主要原因是早期轉(zhuǎn)移可能性大，晚期腫瘤治療效果不佳，對多種化療藥物及放療的反應(yīng)不佳[9]。目前關(guān)于黑色素瘤的主要治療方式有手術(shù)和放療，手術(shù)針對局部黑色素瘤的治療效果較好，而皮膚多部位的黑色素瘤的治療主要依靠放療[10]。所以研究黑色素瘤的分子生物學(xué)機制是改善目前臨床治療效果的有效途徑，并可在一定程度上減少放療的副作用。

miR-let-7b是在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種調(diào)控因子，miR-let-7b的異常表達(dá)與多種類型的腫瘤細(xì)胞的癌基因的表達(dá)相關(guān)，其在不同類型的腫瘤中扮演促癌或抑癌的作用，具有明顯的組織特異性[11]。之前幾項研究探討了miRNA在黑色素瘤中的調(diào)節(jié)作用，使用定量實時PCR檢查了157種miRNA在原發(fā)性黑色素瘤和良性痣中的相對表達(dá)水平[12]。 Appari等學(xué)者研究指出miR-let-7家族在原發(fā)性黑色素瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，并指出miR-let-7可能與相關(guān)蛋白靶點聯(lián)合影響黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為[13]。而且miR-let-7b參與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進程，可以調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，包括CCND1，E2F1，Cyclin A2和Cyclin D1等等。本研究專注于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CCND1和miR-let-7b之間的關(guān)系，并驗證其為miR-let-7b的直接分子靶標(biāo)。通過后續(xù)的克隆形成實驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測CCND1和miR-let-7b對黑色素瘤細(xì)胞增殖凋亡行為的影響，明確miR-let-7b對黑色素瘤細(xì)胞增殖行為有一定的促進作用。以前的研究報道，子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中miR-let-7b的表達(dá)明顯低于鄰近的正常子宮內(nèi)膜[14]。而最近發(fā)現(xiàn)miR-let-7b的表達(dá)可以干擾實質(zhì)性腫瘤中的進展過程，比如肝癌，胃癌及胰腺癌等，但是關(guān)于miR-let-7b在皮膚黑色素瘤中研究報道甚少，沒有系統(tǒng)的闡釋其具體的作用方式。本研究指出抑制miR-let-7b的表達(dá)可以在一定程度上降低黑素瘤細(xì)胞的增殖能力，并可通過下調(diào)細(xì)胞周期CCND1蛋白阻礙細(xì)胞周期的進展，促進細(xì)胞凋亡。盡管我們認(rèn)為G1細(xì)胞周期阻滯是miR-let-7b表達(dá)下調(diào)后的結(jié)果，但不能排除其他途徑參與調(diào)節(jié)的可能性。目前已發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤（包括甲狀旁腺腺瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，淋巴瘤，肺癌，黑素瘤和前列腺癌）中CCND1的表達(dá)異常，盡管與良性痣相比，轉(zhuǎn)移性皮膚黑色素瘤樣本中CCND1蛋白水平較高，但是涉及的相關(guān)癌基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程也可能有CCND1的參與，表明CCND1的表達(dá)在黑色素瘤的發(fā)展過程中起到一定的調(diào)控作用。之前有研究指出可以通過絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)CCND1表達(dá)，并且通常在黑色素瘤中存在過度活化這現(xiàn)象[15]。結(jié)合本研究的結(jié)果一致表明，在黑素瘤細(xì)胞中，miR-let-7b可以抑制CCND1蛋白的表達(dá)，干擾細(xì)胞周期的進展，扮演促癌因子的作用。

綜上所述，以上結(jié)果有助于解釋黑素瘤中miR-let-7b和CCND1蛋白的異常表達(dá)的現(xiàn)象，并進一步闡釋了兩者在原發(fā)性皮膚黑色素瘤中必要作用，后續(xù)實驗進一步了解miR-let-7b的下調(diào)是否是黑色素瘤遷移和侵襲行為的誘導(dǎo)因素。miR-let-7b在黑色素瘤細(xì)胞中具有有效的抗增殖作用，所以它可能成為黑色素瘤臨床治療的新型分子靶標(biāo)。

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[收稿日期]2018-01-22 [修回日期]2018-03-14

編輯/朱婉蓉