中藥面膜對(duì)痤瘡動(dòng)物模型治療作用的實(shí)驗(yàn)研究

馬佳慧 鐘心 秦澤雨

[摘要]目的：探究中藥面膜對(duì)痤瘡動(dòng)物模型的治療作用。方法：將32只大鼠分為2組，即正常組（n=8）和造模組（n=24）。采用痤瘡丙酸桿菌方法造模，造模成功后分為模型組、維A酸組、藥膜組，每組8只。模型組不做任何處理，維A酸組涂0.1%維A酸乳膏，藥膜組涂抹中藥面膜，連續(xù)治療2周后，用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）法檢測(cè)各組大鼠血清IL-1α、IL-6、TNF-α和IL-2的含量，采用免疫印跡（Western Blot）的方法測(cè)定各組大鼠痤瘡組織中IL-1α、IL-6、TNF-α和IL-2的表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，中藥面膜能夠明顯緩解痤瘡模型大鼠的耳的腫脹率，能夠顯著減少炎癥因子IL-1α、IL-6及TNF-α的血清水平，顯著增加IL-2血清中水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥面膜能夠明顯降低痤瘡組織中炎癥因子IL-1α、IL-6及TNF-α的表達(dá)，顯著增加IL-2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：中藥面膜具有良好的抗炎作用且對(duì)痤瘡模型大鼠具有較好的治療作用。

[關(guān)鍵詞]中藥面膜；痤瘡；炎性因子；治療作用；維A酸乳膏

[中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）07-0072-04

Abstract： Objective To explore the therapeutic effect of Chinese herbal mask on acne animal model. Methods 32 rats were divided into the two groups： the normal control group （n=8） and the modeling group （n=24）. The animal model was established by using Propionibacterium acnes. The model rats were divided into the three groups： the model group， the retinoic acid group and the drug mask group after successful modeling. The model group were treated with nothing， the retinoic acid group were treated with 0.1% Vitamin A acid cream， and the drug mask group were treated with Chinese medicine facial mask. The treatment lasted for 2 weeks. The serum levels of IL-1α，IL-6，TNF-α and IL-2 in each group were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （Elisa）.Western Blot was used to detect the expression of IL-1， IL-6， TNF-α and IL-2 in acne tissues of rats. Results Compared with the model group， the traditional Chinese medicine mask could significantly alleviate the swelling rate of the ears of the rats with acne model， and could significantly reduce the serum level of the inflammatory factors IL-1 alpha， IL-6 and TNF- alpha， and significantly increase the level of IL-2 in the serum， the differences were statistically significant（P<0.05）. Chinese medicine mask could significantly reduce the expression of inflammatory factors IL-1 alpha， IL-6 and TNF- alpha in acne tissues， and significantly increase the expression of IL-2（P<0.05）. Conclusion Chinese medicine facial mask has good anti-inflammatory effect and has a well therapeutic effect on acne model rats.

Key words： Chinese medicine facial mask； acne； inflammatory factors； therapeutic effect； Vitamin A acid cream

中藥面膜不但具有美白潤(rùn)滑的作用，也有淡斑、抗炎、治療痤瘡的功效，且被基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)踐多方證實(shí)[1-2]。七白散是最為經(jīng)典的中藥面膜，廣泛應(yīng)用于臨床，但其是否具有治療痤瘡的作用并未得到證實(shí)。本研究旨在運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法研究該中藥面膜對(duì)痤瘡模型大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響，探究中藥面膜治療痤瘡的作用，為中藥面膜在臨床的開(kāi)發(fā)利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康Wistar大鼠，體重（200±25）g，4～5周齡，雌雄各半，共24只。購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)為SCXK（黑）2013-0004。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑：中藥面膜（實(shí)驗(yàn)室自制）；維A酸乳膏（湖北康正藥業(yè)有限公司）；痤瘡丙酸桿菌（購(gòu)于中科院微生物研究所，菌號(hào)：112236）；酶聯(lián)免疫（Elisa）IL-1α試劑盒、酶聯(lián)免疫（Elisa）IL-2試劑盒、酶聯(lián)免疫（Elisa）IL-6試劑盒、酶聯(lián)免疫（Elisa）TNF-α試劑盒（均購(gòu)于南京建成生物工程研究所）；IL-1α，IL-6，TNF-α，IL-2抗體（均購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；聚合HRP標(biāo)記抗兔lgG（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)）；PMSF（碧云天生物技術(shù)）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科學(xué)有限公司）；5×SDS loading Buffer（HaiGene）；4×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶科學(xué)有限公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科學(xué)有限公司）；超敏ECL發(fā)光液（碧云天生物技術(shù)）；生理鹽水，95%乙醇等試劑（購(gòu)于天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）。

1.3 主要儀器及設(shè)備：酶標(biāo)儀（MUTISKANMK3型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；厭氧罐（AG015，北京恒奧科技有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（HWS-250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；粉碎機(jī)（DFY-1000 溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；電泳設(shè)備及凝膠成像儀（Bio-Rad）。

1.4 方法

1.4.1 藥品制備：中藥面膜粉（白蘞15g、白僵蠶15g、白術(shù)15g、白芨15g、白芷10g、白芍藥10g、白茯苓2.5g、皂角2g、綠豆2g），粉碎后，過(guò)100目篩，用蒸餾水調(diào)成糊狀，備用。

痤瘡丙酸桿菌液：在厭氧條件下將凍干的痤瘡丙酸桿菌用硫乙醇鈉培養(yǎng)基溶解成懸浮狀菌液，放入?yún)捬豕拗信囵B(yǎng)，然后接種于厭氧血平板，放入?yún)捬豕嘀兄?7℃恒溫培養(yǎng)箱24h。無(wú)菌棉簽取出菌落，以生理鹽水洗滌3次，調(diào)整丙酸桿菌濃度為6×107cfu/ml，95℃水浴滅活15min，備用。

1.4.2 動(dòng)物造模：按照經(jīng)典大鼠造模法，在耳廓皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌模擬痤瘡?fù)獠勘憩F(xiàn)及炎性反應(yīng)的發(fā)病過(guò)程，制備大鼠耳痤瘡模型[3]。造模組每只大鼠右耳廓皮內(nèi)注射丙酸桿菌液（6×107cfu/ml）50μl，每天1次，連續(xù)注射3d。第3天再給與每只大鼠腹腔注射丙酸桿菌液（6×107cfu/ml）1ml，每天1次，連續(xù)7d。

1.4.3 動(dòng)物分組及給藥：將32只大鼠隨機(jī)分為2組，其中正常組（n=8），造模組（n=24）。造模完成后，造模組再分成3組：模型組（n=8，不給藥）；維A酸組（n=8，涂抹0.1%維A酸乳膏0.1g，1次/d）；藥膜組（n=8，涂抹中藥面膜，0.2g，1次/d）。連續(xù)給藥14d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)：各組小鼠造模前分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量耳廓厚度。造模后，觀察各組大鼠右耳皮膚狀態(tài)，確定造模是否成功。連續(xù)灌胃給藥14d后，稱重，測(cè)量耳廓厚度，然后腹主動(dòng)脈取血，靜置30min后，置于4℃低溫離心機(jī)，13 500轉(zhuǎn)/min，離心10min。取上層血清，放置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。剪取處死后的大鼠造模處耳組織-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫反應(yīng)吸附測(cè)定法（Elise）測(cè)定大鼠血清中的IL-1α，IL-1β，IL-6，TNF-α含量。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)技術(shù)（Western Blot）測(cè)定大鼠痤瘡組織的IL-1α，IL-1β，IL-6，TNF-α蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA），首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若P>0.05，表明方差齊，采用LSD法進(jìn)行組間比較；若P<0.05，表明方差不齊，采用Tamhanes T2法進(jìn)行組間比較。當(dāng)P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況：正常組大鼠耳廓表皮顏色正常，毛細(xì)血管清晰可見(jiàn)，觸感柔軟輕薄。模型組大鼠耳廓表皮粗糙干燥，皮膚紅腫，毛細(xì)血管不可見(jiàn)觸感變硬變厚。依照實(shí)驗(yàn)性痤瘡判定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，提示大鼠耳廓實(shí)驗(yàn)性痤瘡模型已形成[4]。

2.2 各組大鼠耳腫脹率測(cè)量結(jié)果比較：與正常組相比，模型組大鼠的耳廓有明顯紅腫現(xiàn)象。模型組大鼠與正常組相比，耳廓腫脹率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；給藥后，維A酸組及藥膜組大鼠的耳廓腫脹率均明顯低于模型組（P<0.01），說(shuō)明維A酸和中藥面膜對(duì)痤瘡模型大鼠的炎癥有明顯的抑制作用。見(jiàn)表1，圖1。

2.3 各組大鼠血清中炎性因子水平比較：與正常組相比，模型組大鼠血清中的致炎因子顯著升高，而抑炎因子顯著下降。模型組大鼠血清中的IL-1α、TNF-α、IL-6均明顯高于正常組，而IL-2明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；給藥后，維A酸組及藥膜組大鼠IL-1α、TNF-α、IL-6均明顯低于模型組，IL-2明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2，圖2。

2.4 各組大鼠中炎性因子的蛋白表達(dá)水平：模型組大鼠病變組織中的IL-1α、TNF-α、IL-6均明顯高于正常組，而IL-2明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥后，維A酸組IL-1α、TNF-α、IL-6表達(dá)極顯著低于模型組，IL-2表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；藥膜組IL-1α、TNF-α、IL-6表達(dá)均明顯低于模型組，IL-2表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3～4。

3 討論

痤瘡是一種常見(jiàn)的慢性皮膚疾病，多發(fā)于皮脂腺豐富的部位，由體內(nèi)及體外多種因素引起，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。就當(dāng)前研究結(jié)果表明其發(fā)病因素包括皮脂腺過(guò)度分泌、毛囊中微生物過(guò)度繁殖、毛囊皮脂腺導(dǎo)管的角化異常及其他遺傳因素[5]，而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痤瘡主要由風(fēng)、濕、熱、痰、瘀等外邪所致[6-7]。根據(jù)其發(fā)病原因，臨床上也出現(xiàn)多種治療手段，包括效果顯著的抗雄激素藥物、抗生素、維A酸、過(guò)氧化苯甲酰等西藥，同時(shí)也包括保守治療的中藥熏洗劑、散劑、酊劑、軟膏劑、面膜、凝膠劑等中藥[5-6]。另外，近年也有學(xué)者對(duì)痤瘡的發(fā)病機(jī)制提出了新的見(jiàn)解，認(rèn)為炎癥反應(yīng)貫穿了痤瘡發(fā)病的整個(gè)過(guò)程，所以在痤瘡的治療中抗炎也是貫穿始終的[8]。本文也以典型的炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α和IL-2為指標(biāo)，評(píng)價(jià)中藥面膜在痤瘡的治療過(guò)程中的作用。

痤瘡動(dòng)物模型在實(shí)驗(yàn)性研究中被廣泛應(yīng)用，造模方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，且具有較高的可重復(fù)性。目前多選用兔和大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用煤焦油，氯化烴，油酸，二甲苯及痤瘡丙酸桿菌來(lái)制造痤瘡模型[9-11]。本文選擇了操作更加容易的大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用最為廣泛的痤瘡丙酸桿菌來(lái)造模，其造模時(shí)間僅為7d，成模后可以維持14d[3]。

IL-1α具有免疫刺激作用，能夠誘導(dǎo)IL-6，TNF-α等促炎性因子的表達(dá)，激活放大免疫反應(yīng)[12]。IL-2的主要功能就是提升免疫反應(yīng)，IL-2含量下降，表示T細(xì)胞的分化增殖能力下降，體液的免疫反應(yīng)能力降低[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，中藥面膜能夠減少痤瘡模型大鼠血清中致炎因子IL-1α、IL-6和TNF-α的含量，能夠增加抑炎因子IL-2的含量；同時(shí)，中藥面膜也可以使病變組織中IL-1α、IL-6和TNF-α的表達(dá)降低，IL-2的表達(dá)升高，說(shuō)明中藥面膜在痤瘡的治療中具有明顯的抗炎作用。中藥面膜對(duì)痤瘡的治療作用，可能是其方中的白芷[14]、白芨[15]的抗炎成分起到抑炎的作用，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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[收稿日期]2018-05-09 [修回日期]2018-06-30

編輯/朱婉蓉