單增李斯特菌恒溫?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

賈培 盛司潼 蘭全學(xué)

摘 要：以單增李斯特菌的clfA基因?yàn)榘行蛄?，針?duì)該序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物和探針，建立單增李斯特菌熒光PRA檢測(cè)方法，研制單增李斯特菌熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，并對(duì)其特異性、靈敏性、穩(wěn)定性進(jìn)行分析。結(jié)果表明該恒溫?zé)晒釶CR方法及快速檢測(cè)試劑盒特異性好、穩(wěn)定性好、具有較高的靈敏度，最低可檢測(cè)到0.05 pg/μL，是快速檢測(cè)食源性增李斯特菌的有效方法，對(duì)我國(guó)食源性增李斯特菌的檢測(cè)具有重要應(yīng)用和推廣價(jià)值。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?；恒溫?zé)晒釶CR；試劑盒

中圖分類(lèi)號(hào)：R155 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌）屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是最常見(jiàn)的人畜共患型食源性致病菌之一，能夠引起較嚴(yán)重的人畜共患病，象腸胃炎、腦膜炎、敗血癥等疾病，孕婦、嬰幼兒、老年人及免疫力低下者更易感染。單增李斯特菌廣泛存在于各類(lèi)乳制品、蔬菜、肉類(lèi)等食品中，具有極強(qiáng)的生命力，其能夠在-4 ℃～45 ℃，pH值為4～9，甚至高鹽（14 %及以上）等惡劣環(huán)境條件下生存。對(duì)人的健康構(gòu)成了極大威脅。食品中單增李斯特菌的檢測(cè)技術(shù)則成為食源性疾病預(yù)防與控制的關(guān)鍵。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、靈敏的快速檢測(cè)單增李斯特菌的方法及試劑盒迫在眉睫。

該研究擬根據(jù)單增李斯特菌的clfA基因的保守序列，設(shè)計(jì)RPA檢測(cè)所需的引物及探針，建立一種能夠快速檢測(cè)單增李斯特菌的簡(jiǎn)便、高效、特異、靈敏、適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的技術(shù)方法，研制出單增李斯特氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（RPA—熒光法）對(duì)單增李斯特菌擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株—單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（菌株編號(hào)ATCC 19115）由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司代買(mǎi)；細(xì)菌DNA提取試劑盒，寶生物工程有限公司；RPA擴(kuò)增試劑盒，TwistDX公司；Premix預(yù)混合液，寶生物工程有限公司；引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 主要儀器

恒溫金屬浴，HYK公司；qPCR儀，ABI；PCR儀，Labnet；Flurometer，ABI；NanoDrop，Thermo等。

1.3 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

擬利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目前相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)單增李斯特菌的常用靶基因進(jìn)行BLAST分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)的比對(duì)分析，從中查詢(xún)適用于RPA檢測(cè)的靶序列，以此來(lái)設(shè)計(jì)引物及探針（見(jiàn)表1），所擴(kuò)增的基因序列作為檢測(cè)單增李斯特菌的靶基因。

1.4 模板DNA的制備

將單增李斯特菌在37 ℃條件下震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，按照寶生物工程有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取DNA，分為菌體裂解，DNA與膜結(jié)合，DNA純化等過(guò)程，取上清液作為檢測(cè)模板，在-20 ℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的建立

將單增李斯特菌培養(yǎng)后，提取DNA模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：包括測(cè)試buffer 45.5 μL（水化buffer 29.5 μL，去離子水11.2 μL，探針0.6 μL，上下游引物各為2.1 μL）、DNA模板2.0 μL、Mg2+2.5 μL。反應(yīng)時(shí)間20 min，反應(yīng)溫度為37 ℃，30 s/循環(huán)，30個(gè)循環(huán)，熒光收集信號(hào)。

1.6 特異性分析

制備菌株DNA樣品，使用96孔板，按以下方式均勻混合制備待測(cè)樣品并進(jìn)行排版，見(jiàn)表2，反應(yīng)體系和程序參考1.5。

1.7 靈敏度分析

取1 mL菌株培養(yǎng)液，提取DNA（濃度為5.34 ng/uL），以此為模板，用水分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍等5個(gè)梯度；取3管凍干粉，加入136.5 μL測(cè)試buffer，每管平分22.75 μL，再加入1 μL稀釋模板和陰性對(duì)照樣品，1.25 μL醋酸鎂溶液，測(cè)試5個(gè)模板梯度和一個(gè)陰性對(duì)照。

1.8 穩(wěn)定性測(cè)試

通過(guò)加速實(shí)驗(yàn)確定試劑盒的穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)3個(gè)保存溫度，分別為25 ℃、35 ℃、45 ℃，放置天數(shù)分別為2天、8天、14天、17天；每個(gè)條件取配置700 μL測(cè)試buffer，每個(gè)溫度條件每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)取45.5 μL buffer和1管凍干粉（作為一個(gè)獨(dú)立包裝）；將每個(gè)包裝的凍干粉用對(duì)應(yīng)的buffer溶解，然后配制成2個(gè)25 μL的反應(yīng)體系（參照1.5），由于樣品較多，采用冰上加樣方式，確保反應(yīng)同時(shí)開(kāi)始；）測(cè)試采用試劑盒提取的基因組DNA樣本，對(duì)應(yīng)的樣品濃度為單增李斯特菌18.3 pg/μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單增李斯特氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（RPA—熒光法）的特異性

利用所建立的恒溫?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)單增李斯特菌，結(jié)果如圖1所示，待測(cè)陽(yáng)性樣品均有擴(kuò)增曲線(xiàn)，空白對(duì)照的擴(kuò)增曲線(xiàn)呈陰性，從而說(shuō)明熒光PCR檢測(cè)試劑盒的單增李斯特菌特異性良好，能夠有效地將單增李斯特菌從其他菌中區(qū)分出來(lái)。

2.2 單增李斯特氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（RPA—熒光法）的靈敏度

利用熒光PCR方法開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)試劑盒分別對(duì)不同濃度的模板進(jìn)行檢測(cè)，如圖2所示，空白對(duì)照試驗(yàn)無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，證明測(cè)試結(jié)果有效，最低檢測(cè)限對(duì)應(yīng)樣品濃度為單增李斯特菌0.05 pg/?L。從而表明熒光RPA快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)單增李斯特菌的靈敏度可以達(dá)到0.05 pg/μL。

2.3 單增李斯特氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（RPA—熒光法）的穩(wěn)定性測(cè)試

單增李斯特氏菌核酸檢測(cè)試劑盒在3種不同溫度條件下顯示（見(jiàn)表3），溫度每升高10 ℃，反應(yīng)速率就會(huì)增加2～4倍，反之溫度每降低10 ℃，反應(yīng)速率就會(huì)降低2～4倍，按照降低2倍的參數(shù)計(jì)算，從-20℃～25 ℃，溫度降低了4.5個(gè)10 ℃，反應(yīng)速率降低22倍，25 ℃下放置17天的變化等同于-20 ℃放置374天。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行低溫折算（見(jiàn)表4），發(fā)現(xiàn)均在180天以上，據(jù)此試劑盒的有效期至少可判定為：-20 ℃保存6個(gè)月。

以偏差在20%以?xún)?nèi)的變化作為接受標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)不同試劑盒在不同溫度下的最長(zhǎng)保存天數(shù)。

2.4 討論

單增李斯特菌是引起食源性疾病的常見(jiàn)致病菌，該研究所開(kāi)發(fā)的熒光RPA方法及檢測(cè)試劑盒可以快速高效地檢測(cè)單增李斯特菌。相比于目前的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、熒光PCR方法，恒溫?zé)晒釶CR方法檢測(cè)時(shí)間短，在20 min內(nèi)就可以得到檢測(cè)結(jié)果；通過(guò)靈敏度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法特異性好，穩(wěn)定性好，對(duì)于單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.05 pg/μL。 此外，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的檢測(cè)過(guò)程煩瑣，熒光PCR方法的檢測(cè)過(guò)程包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，且每個(gè)過(guò)程都需要不同溫度，這就迫使熒光PCR方法需要溫度調(diào)節(jié)裝置，設(shè)備費(fèi)用高，而熒光RPA方法是一種等溫?cái)U(kuò)增程序，且反應(yīng)溫度在35 ℃～42 ℃，不需要復(fù)雜的溫度控制裝置。因此開(kāi)發(fā)熒光RPA方法及快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)單增李斯特菌具有重要的實(shí)際意義。

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