超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查水產(chǎn)品中16種激素殘留

陳秋華，張?zhí)炻?，傅 紅,3，黃東仁

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003；3.福州大學(xué) 福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州 350108）

激素是指由體內(nèi)的某一細(xì)胞、腺體或者器官所產(chǎn)生的可以影響機體內(nèi)其他細(xì)胞活動的化學(xué)物質(zhì)，主要包括性激素、孕激素和糖皮質(zhì)激素等[1]。激素具有提高飼料轉(zhuǎn)化率、縮短動物生長周期、促進動物生長繁殖等作用，因此存在在水產(chǎn)養(yǎng)殖中違規(guī)使用以提高經(jīng)濟效益的現(xiàn)象[2-5]。研究表明，食品中激素的殘留會導(dǎo)致性早熟、乳腺癌及前列腺癌發(fā)病率提高[6-7]。2002年我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中已禁止使用諾龍、甲基睪丸酮、群勃龍等激素物質(zhì)，并規(guī)定這些化合物在動物性食品中不得檢出[8]。同時歐盟第96/22/EC指令、美國食品藥物管理局也禁止在動物源性食品中使用激素類藥物[9]。

目前激素類藥物的殘留檢測方法主要有高效液相色譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法[11-14]、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法[15-18]等。其中液相色譜法無法區(qū)分保留時間相同或相近的物質(zhì)，因而定性能力較差。液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法憑借多反應(yīng)監(jiān)測模式，其靈敏度和定性能力都較高，是目前主要的檢測方法，但受分辨率、掃描速率及分析模式的限制，無法實現(xiàn)高通量快速篩查分析[19]。液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法具有高分辨率、高通量、靈敏度高的特點，可實現(xiàn)復(fù)雜食品基質(zhì)中目標(biāo)物的定性分析和高通量快速篩查分析，同時還可通過建立篩查譜庫實現(xiàn)在無標(biāo)準(zhǔn)品情況下對目標(biāo)物進行篩查和確認(rèn)[20-23]。

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）是由Anastassiades等[24]于2003年建立的樣品前處理技術(shù)，具有操作簡單、分析速度快、分析范圍廣等優(yōu)點，此方法已廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測，近年來也逐漸被用于動物性食品中獸藥殘留的檢測[25-27]。熊雯等[28]建立了檢測水產(chǎn)品中18 種磺胺類藥物的QuEChERS-液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜方法。朱萬燕等[29]建立了快速檢測豬肉中33 種獸藥殘留的QuEChERS-液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜方法。但目前采用QuEChERS-液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜方法同時對多種水產(chǎn)品基質(zhì)中的激素殘留進行篩查分析的文獻報道還較少。本實驗通過超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatographyquadrupole time of fl ight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）技術(shù)建立篩查數(shù)據(jù)庫，同時采用改進的QuEChERS方法結(jié)合UPLC-Q-TOF MS技術(shù)建立水產(chǎn)品中激素快速、有效的篩查方法，以期為水產(chǎn)品中激素殘留風(fēng)險監(jiān)測提供有效技術(shù)手段，同時為水產(chǎn)品中獸藥殘留的篩查分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

勃地酮、甲睪酮、睪酮、諾龍、美雄酮、表睪酮、群勃龍、17α-羥基孕酮、甲羥孕酮乙酸酯、乙酸氯地孕酮、21α-羥基孕酮、乙酸甲地孕酮、醋酸美倫孕酮、孕酮、氫化可的松、潑尼松、睪酮-D3（純度均大于93.6%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、丙酮（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Scientific公司；乙酸（色譜純）美國Tedia公司；無水硫酸鎂（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（農(nóng)殘級） 上海安譜公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY H-CLASS型UPLC儀、Xevo G2-S型Q-TOF MS儀 美國Waters公司；V-700旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國Heidolph公司；3-30K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；MS3 digital旋渦振蕩器 德國IKA公司；multi Reax振蕩器 德國Heidolph公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的單標(biāo)儲備液，避光保存于-18 ℃冰箱。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇定容為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于4 ℃冰箱。用甲醇-水體積比35∶65稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液獲得1、5、10、25、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中標(biāo)準(zhǔn)工作液中均含有20 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)睪酮-D3，將標(biāo)準(zhǔn)工作液保存于4 ℃冰箱。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入80 μL 500 ng/mL的激素混標(biāo)溶液，靜置15～20 min，加入10 mL 1%乙酸-乙腈溶液，渦旋混勻1 min，加入鹽析劑（2 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉），渦旋混勻1 min，在4 ℃、10 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液5 mL于新的15 mL離心管中，加入3 mL正己烷，渦旋混勻1 min，在4 ℃、5 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層。再往離心管中加入凈化劑（800 mg無水硫酸鎂和150 mg C18（南美白對蝦、大黃魚、草魚基質(zhì)）或200 mg C18（梭子蟹基質(zhì)）），渦旋混勻2 min，在4 ℃、5 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確移取3 mL上清液于25 mL雞心瓶中。38 ℃旋蒸至干，用1 mL含20 ng/mL睪酮-D3的定容液（甲醇-水體積比35∶65）復(fù)溶，過0.22 μm有機濾膜，待上機測定。

1.3.3 UPLC條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度10 ℃；進樣體積10 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；流速0.3 mL/min；梯度洗脫條件：0～1 min，35% B；1～5 min，35%～65% B；5～8 min，65%～80% B；8～11 min，80%～98% B；11～14 min，98% B；14～15 min，98%～35% B；15～18 min，35% B。

1.3.4 MS條件

離子源：電噴霧離子源；電離模式：正離子；檢測模式：MSE；質(zhì)量數(shù)采集范圍：50～1 000 Da；毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：420 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；錐孔電壓：40 V；LockSpray程序：采用亮氨酸腦啡肽（1 μg/mL，m/z 556.277 1）每10 s切換一次對質(zhì)量數(shù)進行實時校正。

1.3.5 數(shù)據(jù)庫的建立

本實驗在MSE全掃描模式下，在低能量碰撞通道獲得目標(biāo)物的保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)等信息，在高能量碰撞通道獲得目標(biāo)物的子離子精確質(zhì)量數(shù)。在MS/MS模式下，通過相應(yīng)碰撞能量下的離子碎片信息進一步確證。借助Waters公司Masslynx 4.1軟件中的fragment軟件分析化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息。最后通過Chromalynx xs數(shù)據(jù)庫軟件，建立包含16 種激素名稱、分子式、保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、子離子等信息的篩查數(shù)據(jù)庫。具體的數(shù)據(jù)庫信息如表1所示，色譜圖見圖1。

表1 激素的分子式、CAS號、保留時間、提取質(zhì)量數(shù)、子離子Table 1 Molecular formula, CAS No., retention time, m/z and product ion of 16 hormones

圖1 16 種激素的色譜提取圖Fig. 1 Extracted ion chromatogram of 16 hormones

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)的計算

基質(zhì)效應(yīng)的消除方法主要有內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)匹配等?；|(zhì)效應(yīng)是通過比較目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┡c在基質(zhì)中的峰面積進行評估的，其計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理

在Chromalynx xs軟件中，運用建立好的數(shù)據(jù)庫對UPLC-Q-TOF MS采集的樣品數(shù)據(jù)進行檢索匹配分析，利用質(zhì)譜軟件的自動去卷積功能，并與數(shù)據(jù)庫的保留時間、精確母離子質(zhì)量數(shù)、子離子質(zhì)量數(shù)等相關(guān)參數(shù)進行對比，當(dāng)分析物與譜庫中化合物的保留時間偏差小于±0.2 min，母離子和子離子質(zhì)量數(shù)偏差小于±3 mu時，顯示為陽性結(jié)果，隨后針對陽性化合物使用targetlynx軟件進行定量分析。與MS/MS相比，Q-TOF具有更快的掃描速度和更高的質(zhì)量精度，從而可實現(xiàn)高通量篩查，另外本方法構(gòu)建的是一個開放的體系，待測樣品一次進樣，經(jīng)Q-TOF全掃描獲得的全譜數(shù)據(jù)可多次使用，后期可通過不斷增加數(shù)據(jù)庫中的化合物來擴展對原樣品數(shù)據(jù)的篩查范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS條件優(yōu)化結(jié)果

為獲得最佳的電離效率、提高靈敏度，本實驗以100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)總離子流響應(yīng)值和各化合物的分子離子峰響應(yīng)值的強度確定最佳質(zhì)譜參數(shù)。以錐孔電壓為例，錐孔電壓太小會降低檢測靈敏度，太大則會造成離子源內(nèi)裂解，本實驗研究了16 種激素在錐孔電壓為30～100 V時分子離子峰的響應(yīng)情況，實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)錐孔電壓為42 V時，激素總體響應(yīng)值最高，同理對質(zhì)譜的離子源溫度（100～150 ℃），去溶劑化溫度（350～500 ℃）和脫溶劑氣流速（500～1 000 L/h）進行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見1.3.4節(jié)。

2.2 QuEChERS樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的優(yōu)化結(jié)果

本實驗考察乙腈、1%乙酸-乙腈溶液、乙酸乙酯和丙酮4 種提取劑的效果。如圖2所示，分別用南美白對蝦、大黃魚和梭子蟹為基質(zhì)，1%乙酸-乙腈溶液作為提取劑時16 種激素的平均回收率分別為83.3%、81.4%和83.8%，均高于乙腈、乙酸乙酯和丙酮，因而本實驗選用1%乙酸-乙腈溶液作為提取溶劑。實驗中還發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯和丙酮作為提取劑時，共提物較多，增加了提取液后期的凈化難度，有乙腈存在的體系中共提物較少，這可能因為乙腈具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，有利于后期的凈化。

圖2 不同提取劑對16 種激素回收率的影響Fig. 2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of 16 hormones

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化結(jié)果

QuEChERS方法常用的吸附劑有乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、中性氧化鋁（Alu-N）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）等，其中C18和Alu-N主要用于去除樣品中的脂肪、脂類等非極性有機物，而PSA和GCB主要用于去除樣品中的色素、有機酸和糖類等物質(zhì)。本實驗分別考察以PSA、C18、Alu-N以及PSA-Alu-N、PSA-C18、PSA-C18-GCB作為凈化劑時的凈化效果，南美白對蝦、大黃魚、梭子蟹基質(zhì)的凈化效果如圖3～5所示。實驗結(jié)果表明，以C18吸附劑作為凈化劑時16 種激素凈化效果最好，在南美白對蝦、大黃魚和梭子蟹基質(zhì)中，其回收率分別在61.9%～93.9%、64.2%～119.7%、55.6%～112.5%范圍內(nèi)。因此本實驗采用選擇C18作為吸附劑。本實驗還進一步對C18的用量進行優(yōu)化，對比了100、150、200、250、300 mg C18吸附劑對目標(biāo)化合物回收率的影響，實驗結(jié)果如圖6所示，在南美白對蝦、大黃魚和梭子蟹基質(zhì)中，C18吸附劑加入量分別為150、150、200 mg時凈化效果最好，16 種激素平均回收率分別為83.5%、85.6%、84.0%。其中C18吸附劑加入量過低或過高都會使回收率降低，這可能是由于C18吸附劑加入量不夠時，無法凈化充分；而加入量過多時，吸附劑本身對激素也存在一定的吸附作用。

圖3 南美白對蝦基質(zhì)中不同吸附劑對16 種激素的回收率的影響Fig. 3 Effects of different sorbents on the recoveries of 16 hormones in Penaeus vannamei matrix

圖4 大黃魚基質(zhì)中不同吸附劑對16 種激素的回收率的影響Fig. 4 Effects of different sorbents on the recoveries of 16 hormones in Pseudosciaena crocea matrix

圖5 梭子蟹基質(zhì)中6 種吸附劑對16 種激素的回收率的影響Fig. 5 Effects of different sorbents on the recoveries of 16 hormones in swimming crab matrix

圖6 C18吸附劑添加量對16 種激素回收率的影響Fig. 6 Effects of C18 amount on the recoveries of 16 hormones

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在-20%～20%范圍內(nèi)時，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，超過20%時，表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)增強效應(yīng)，低于-20%時，表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)[30]。如表2所示，在南美白對蝦基質(zhì)中，16 種激素的基質(zhì)效應(yīng)均在±20%范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；在大黃魚基質(zhì)中，勃地酮、美雄酮、潑尼松表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)；在梭子蟹基質(zhì)中，美雄酮表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，氫化可的松表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)增強效應(yīng)；在草魚基質(zhì)中，勃地酮、美雄酮、表睪酮、潑尼松表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，本實驗采用通過基質(zhì)匹配溶液的方法對基質(zhì)效應(yīng)進行校正。

2.3.2 線性范圍、檢出限和定量限

表2 激素的基質(zhì)效應(yīng)、方法LOD和LOQTable 2 Matrix effects, LODs and LOQs for all matrices tested

將4 種空白基質(zhì)樣品按1.3.2節(jié)處理后，添加不同質(zhì)量濃度（1、5、10、25、50、100 μg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各激素母離子的峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各激素在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，16 種激素在南美白對蝦、大黃魚、梭子蟹、草魚4 種基質(zhì)中的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0.994 5～0.999 9、0.993 8～0.999 9、0.990 6～0.999 9、0.996 4～0.999 6。

以3 倍信噪比為檢出限（limit of detection，LOD），10 倍信噪比為定量限（limit of quantitation，LOQ）。如表2所示，16 種激素在南美白對蝦基質(zhì)中的方法LOD為0.2～1.2 μg/kg，LOQ為0.8～4.0 μg/kg；在大黃魚基質(zhì)中的方法LOD為0.4～2.7 μg/kg，LOQ為0.8～4.0 μg/kg；在梭子蟹基質(zhì)中的方法LOD為0.4～2.5 μg/kg，LOQ為1.5～8.2 μg/kg；在草魚基質(zhì)中的方法L O D為0.3～2.1 μ g/k g，LOQ為0.9～7.0 μg/kg。

2.3.3 回收率和精密度

在10、20、50 μg/kg三個添加水平下做回收率實驗，以考察方法的準(zhǔn)確性和精密度（表3），16 種激素在南美白對蝦基質(zhì)中的回收率為64.1%～102.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.9 3%～7.6%；在大黃魚基質(zhì)中的回收率為65.2%～98.6%，RSD為1.9%～10.9%；在草魚基質(zhì)中的回收率為68.8%～114.4%，RSD為1.2%～9.2%；在梭子蟹基質(zhì)中，除孕酮和潑尼松外，其余14 種激素的回收率為60.5%～121.0%，RSD為1.6%～10.4%，孕酮和潑尼松的回收率分別為53.6%～60.8%和91.7%～135.2%，RSD分別為2.3%～4.5%和2.7%～7.6%，這可能是由于梭子蟹基質(zhì)中存在一些無法去除的雜質(zhì)造成的基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強效應(yīng)，但本方法仍可保證二者的回收率處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)?？傮w上，本研究建立的方法可滿足水產(chǎn)品中16 種激素的實際檢測要求。

表3 激素類化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery and repeatability (RSD) for all matrices tested (n=6)%

續(xù)表3

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

采用本方法對36 份水產(chǎn)品樣品（南美白對蝦、大黃魚、草魚、鯉魚）進行檢測，其中大黃魚和南美白對蝦樣品均無檢出，6 份草魚樣品檢出氫化可的松，含量為5.9～204.1 μg/kg，8 份鯉魚樣品中檢出氫化可的松，含量為12.3～105.6 μg/kg。氫化可的松是天然存在的一種腎上腺糖皮質(zhì)激素，同時也可由人工合成使用。孫利東等[31]對雞肉和牛奶中氫化可的松的本底值進行測定，其結(jié)果在0.06～0.43 μg/kg范圍內(nèi)，這表明生物體內(nèi)氫化可的松的本底值較低。但本次實際檢測樣品中檢出的氫化可的松含量相對較高，外用導(dǎo)致的可能性較大。這與李晴[32]、蔡惠堅[33]等分別在寶石斑魚、草魚中檢出氫化可的松的報道一致，表明在此類水產(chǎn)品中存在使用該激素的可能。目前我國農(nóng)業(yè)部235號公告[8]規(guī)定允許在動物源食品中使用氫化可的松，且無最高殘留限量要求，而文獻[34]規(guī)定了牛奶中氫化可的松的最大殘留限量為10 μg/kg，表明氫化可的松仍有危害人體健康的可能，因此針對水產(chǎn)品中氫化可的松的殘留，也應(yīng)提前開展相關(guān)的風(fēng)險監(jiān)測工作。

3 結(jié) 論

本實驗優(yōu)化了QuEChERS前處理方法，并結(jié)合UPLCQ-TOF MS技術(shù)，建立快速篩查魚、蝦、蟹等水產(chǎn)品中16 種激素殘留的方法。本方法前處理簡單高效，目標(biāo)激素回收率滿足篩查需求，同時結(jié)合高分辨質(zhì)譜，使篩查結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，是開展水產(chǎn)品中多激素殘留快速篩查的一種有效手段。