胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白及結(jié)構(gòu)分析

宋正規(guī)，朱麗娜，張洪超，薛張芝，李和生*，付晶晶，周 偉

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

馬面魚又稱綠鰭?cǎi)R面鲀，多產(chǎn)于黃海、東海、日本海、朝鮮海等領(lǐng)域，其中東海產(chǎn)量最多，已成為我國(guó)僅次于帶魚的第二大海洋經(jīng)濟(jì)魚類。馬面魚肉被普遍應(yīng)用于工廠加工、餐廳食材制作[2]，魚皮多半被當(dāng)作廢料丟棄。馬面魚皮約占馬面魚質(zhì)量的12%，如能高值化利用，便能變廢為寶，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益。膠原蛋白是動(dòng)物細(xì)胞合成的一種具有生物活性的高分子化合物，是人體皮膚的重要組成部分，同時(shí)也是結(jié)締組織重要組成，起到支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用[3]。馬面魚皮含有大量可溶性膠原蛋白，而且氨基酸種類含量豐富，易于吸收，綜合利用率高，對(duì)于幼童和老人營(yíng)養(yǎng)更佳[4]。

梁建華[5]用檸檬酸、乙酸和乳酸提取了羅非魚皮膠原蛋白，其中乳酸的提取率最高。楊玲等[6]分別用檸檬酸和乙酸提取波羅的海鱈魚皮膠原蛋白，24 h內(nèi)分3 個(gè)階段用檸檬酸提取膠原蛋白，約有85%的膠原蛋白能夠被分離出來(lái)，用0.5 mol/L的乙酸溶液連續(xù)提取24 h可得到相似的產(chǎn)率。李燕等[7]比較研究了采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶從豬皮中提取膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)采用胰蛋白酶提取膠原蛋白得率最高，但結(jié)構(gòu)破壞較為嚴(yán)重，而用胃蛋白酶提取的膠原蛋白結(jié)構(gòu)保存最為完整。鐘朝輝等[8]用胃蛋白酶法提取草魚鱗膠原蛋白，并對(duì)其基本特性進(jìn)行研究，紅外光譜和圓二色譜分析表明該膠原蛋白具有典型的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)選取馬面魚皮為主要原料,選擇酶法常用的胃蛋白酶提取膠原蛋白，并對(duì)酶法提取馬面魚皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，通過對(duì)加酶量、緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間工藝條件的優(yōu)化，為馬面魚皮膠原蛋白的提取、利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)于變廢為寶、提高馬面魚的附加值有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬面魚購(gòu)于寧波莊市菜市場(chǎng)，流水解凍后，去皮，清水清洗干凈，陰涼處自然晾干，然后用剪刀剪碎，裝入密封袋封口后在-20 ℃條件下貯藏備用。

胃蛋白酶、酪蛋白 上海星科生物科技有限公司；福林-酚試劑（密封貯存于4 ℃冰箱中避光保存） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；H-1650高速臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；pHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；AFC-2000-G實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)、氨基酸分析儀 德國(guó)賽卡姆公司；紫外-可見光譜儀 美國(guó)Varian公司；Jasco FT/IR-4700傅里葉變換紅外光譜儀 日本分光公司。

1.3 方法

1.3.1 胃蛋白酶活力的測(cè)定

參照楚水晶[9]報(bào)道方法測(cè)定胃蛋白酶活力。經(jīng)測(cè)定，酶粉稀釋液的凈吸光度平均值為0.327 2，通過酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線查得所用胃蛋白酶活力為2 800 U/mg。

1.3.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用比色法測(cè)定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。羥脯氨酸質(zhì)量濃度范圍0～4 μg/mL，以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程為y=0.173 7x+0.018 6（R2=0.995 8）。

1.3.3 馬面魚皮的預(yù)處理

精確稱取魚皮200.00 g，用含有1% H2O2、3% NaCl、0.1 mol/L NaOH的溶液浸泡魚皮，料液比1∶30（g/mL），放置在4 ℃冰箱中進(jìn)行脫色、脫雜蛋白處理，6 h后取出過濾，魚皮備用。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)選取加酶量、緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間4 個(gè)因素，分析各因素對(duì)馬面魚皮膠原蛋白提取率的影響。

1.3.4.1 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

用pH 3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液浸泡溶脹處理后的魚皮，溶脹12 h勻漿，加胃蛋白酶量分別為10 000、12 500、15 000、17 500、20 000 U/g，料液比1∶30（g/mL），4 ℃提取20 h后，10 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液，測(cè)定羥脯氨酸的含量。

1.3.4.2 緩沖液pH值對(duì)膠原蛋白提取率的影響

分別選用pH 2.2、2.6、3.0、3.4、3.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液浸泡溶脹處理后的魚皮，溶脹12 h之后勻漿，選用胃蛋白酶提取，加酶量為15 000 U/g，料液比1∶30（g/mL），在4 ℃提取20 h，10 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液，測(cè)定羥脯氨酸的含量。

1.3.4.3 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

用pH 3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液浸泡溶脹處理后的魚皮，溶脹12 h之后勻漿，選用胃蛋白酶提取，加酶量為15 000 U/g，料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），提取20 h后，10 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液，測(cè)定羥脯氨酸的含量。

1.3.4.4 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

用pH 3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液浸泡溶脹處理后的魚皮，溶脹12 h之后勻漿，選用胃蛋白酶提取，加酶量為15 000 U/g，料液比1∶30，分別提取10、15、20、25、30 h后，10 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液，測(cè)定羥脯氨酸的含量。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.06軟件，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取加酶量、緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間4 個(gè)因素，以提取率為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.6 膠原蛋白的純化

在膠原蛋白提取液中加入氯化鈉晶體，邊加入邊攪拌，使溶液中氯化鈉最終濃度為1 mol/L，倒去上層溶液，將下層溶液與析出白色絮狀物一并倒入截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000的透析袋中，采用10 倍于膠原蛋白溶液體積的純水溶液進(jìn)行脫鹽，每隔6 h換水一次，脫鹽48 h，倒入培養(yǎng)皿，冷凍干燥透析袋內(nèi)液體。

1.3.7 膠原蛋白結(jié)構(gòu)分析

1.3.7.1 氨基酸組成測(cè)定

膠原蛋白溶于6 mol/L鹽酸溶液，130 ℃微波消解60 min，氨基酸自動(dòng)分析儀分析氨基酸組成[11]。

1.3.7.2 紫外吸收光譜分析

將膠原蛋白溶解于0.5 mol/L的醋酸溶液，配成2 mg/mL的膠原蛋白溶液，于190～400 nm近紫外光區(qū)處進(jìn)行掃描。

1.3.7.3 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

測(cè)試前，樣品保存在硅膠干燥器中室溫干燥24 h以脫除大部分水分。向樣品中加入KBr研磨，壓片。使用傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。光譜范圍4 000～400 cm-1；分辨率4 cm-1；樣品掃描次數(shù)32。

1.3.7.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

采用SDS-PAGE，10%的分離膠和5%的濃縮膠，Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。取凍干樣品溶解于0.1 mol/L酒石酸溶液中，加2×SDS樣品緩沖液混合稀釋，100 ℃煮沸處理5 min，自然冷卻后上樣。用微量加樣器分別吸取處理好的樣品10 μL及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，輕輕加入加樣槽內(nèi)。恒壓條件下用80 V電壓，樣品在濃縮膠內(nèi)濃縮成一條線進(jìn)入分離膠后，加大電壓值到140 V，電泳結(jié)束后倒入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，平緩搖動(dòng)染色1～2 h。隨后倒出染色液，加入甲醇-乙酸脫色液，平緩搖動(dòng)脫色至條帶清晰，背景為淺色或無(wú)色，期間換脫色液數(shù)次[12]。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

利用SAS 9.4軟件對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，所有數(shù)據(jù)均采用 ±s表示，不同處理間差異采用One-Way ANOVA進(jìn)行比較分析，以P值小于0.05為差異顯著，最終利用OriginPro 8.5對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)作圖。膠原蛋白SDS-PAGE圖采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

膠原蛋白易受溫度影響，造成三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、肽鍵及其各鏈之間鏈接斷裂，為保證所提膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在4 ℃條件下進(jìn)行。

2.1.1 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

如圖1所示，隨著加酶量的增多，提取率提高，當(dāng)加酶量增大到15 000 U/g時(shí)，底物不足使提取反應(yīng)飽和，此時(shí)，底物濃度是影響提取率的主要因素，在底物濃度保持不變的條件下，增加加酶量，提取率增長(zhǎng)緩慢，根據(jù)圖1可知，胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白的加酶量最佳選擇為15 000 U/g。

圖1 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig. 1 Effect of enzyme dosage on extraction efficiency of collagen

2.1.2 緩沖液pH值對(duì)膠原蛋白提取率的影響

圖2 緩沖液pH值對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig. 2 Effect of buffer pH values on extraction efficiency of collagen

由圖2可知，當(dāng)pH值為3.0時(shí)，胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白的最大提取率為26.4%。

2.1.3 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

圖3 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig. 3 Effect of solid to solvent ratio on extraction ef fi ciency of collagen

如圖3所示，隨著提取試劑用量的增加，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大值26.7%，料液比1∶30之后，提取率未有明顯增加。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on extraction efficiency of collagen

如圖4所示，在提取反應(yīng)初期，較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，馬面魚皮中的反應(yīng)底物還沒有完全溶于提取液中，所以膠原蛋白提取率較低，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)底物的溶解量不斷增大，相應(yīng)地，提取率提高，且提取率增長(zhǎng)率較大，在反應(yīng)進(jìn)行20 h后，反應(yīng)底物基本溶解完全，所以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，提取率變化不大，提取率增長(zhǎng)緩慢。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白工藝結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken法進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以馬面魚皮膠原蛋白的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化得出29 組試驗(yàn)安排，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)有各因素自變量取值所構(gòu)成的24 個(gè)三維頂點(diǎn)和重復(fù)5 次試驗(yàn)以估計(jì)誤差的區(qū)域中心零點(diǎn)，共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)馬面魚皮膠原蛋白的提取率進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到馬面魚皮膠原蛋白提取率回歸方程：Y=26.82+2.08A-0.59B-0.66C+1.17D-0.75AB+0.40AC-0.55AD-0.10BC+0.22BD+0.075CD-1.57A2-5.16B2-2.76C2-1.39D2。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

對(duì)所得到的回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，其結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,模型P小于0.000 1，說明回歸模型達(dá)到極顯著水平，且失擬項(xiàng)P為0.067 5大于0.05，說明回歸模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，絕對(duì)系數(shù)R2為0.976 9，說明97.69%的馬面魚皮膠原蛋白提取率可用該回歸方程分析預(yù)測(cè)得到，該模型擬合程度良好，回歸方程很好地描述了試驗(yàn)各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以通過此模型分析和預(yù)測(cè)胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白的工藝參數(shù)。校正絕對(duì)系數(shù)R2Adj為0.953 9，與R2接近，說明該模型有充分的通用性和準(zhǔn)確性，并表明有占總變異的4.61%不能用該模型來(lái)解釋。變異系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度，精確度越小說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性越大，本試驗(yàn)變異系數(shù)3.06%，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，精密度為18.855，遠(yuǎn)大于4，說明該模型可以用來(lái)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。從表3還可以看出，該模型的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)AB對(duì)提取率影響顯著，其他因素的影響不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面交互效應(yīng)分析

在加酶量、緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間某兩個(gè)因素條件固定不變（0水平）的情況下,根據(jù)回歸方程繪制交互項(xiàng)的三維響應(yīng)面及與之對(duì)應(yīng)的等高線，考察交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響，并對(duì)模型進(jìn)行降維分析。

等高線的形狀及三維響應(yīng)面坡度陡峭程度可以反映各因素相互作用的強(qiáng)弱，等高線形狀為鞍形或橢圓形，說明兩者的交互作用顯著；等高線形狀為圓形，則說明兩者交互作用不顯著[13-14]。三維響應(yīng)面坡度平緩說明響應(yīng)值對(duì)交互因素變化不敏感；坡度陡峭，則說明響應(yīng)值對(duì)交互因素變化敏感[15-16]。本試驗(yàn)因素間交互作用的等高線及響應(yīng)面如圖5所示。

圖5 交互作用對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig. 5 Interactive effects of various factors on the yield of collagen

由圖5a可知，當(dāng)加酶量不變時(shí)，膠原蛋白提取率隨緩沖液pH值升高先增大后減小，說明緩沖液pH值過高或者過低，都不利于提取，這和胃蛋白酶最適pH值為3有密切關(guān)系，當(dāng)緩沖液pH值不變時(shí)，膠原蛋白提取率隨加酶量的增加而增大，但加酶量過高，容易造成膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，同時(shí)根據(jù)等高線為橢圓形可以得出，加酶量和緩沖液pH值交互作用明顯，這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。由圖5b可知，當(dāng)料液比不變時(shí)，膠原蛋白的提取率隨加酶量的增加而增大，加酶量不變時(shí)，隨著料液比的變化，提取率呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。由圖5c可知，當(dāng)加酶量不變時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取率逐漸增大，但提取24 h后，提取率增加不再明顯，當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，提取率隨加酶量的增加而增大。由圖5d可知，當(dāng)料液比不變時(shí)，膠原蛋白提取率隨緩沖液pH值升高先增大后減小，當(dāng)緩沖液pH值不變時(shí)，膠原蛋白提取率隨料液比變大先增大后減小。由圖5e可知，當(dāng)緩沖液pH值不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，膠原蛋白提取率隨緩沖液pH值升高先增大后減小。由圖5f可知，當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率變化較小，當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，提取率隨料液比的變化先增大后減小。

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件建立的模型對(duì)胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最大提取率的最佳工藝條件為加酶量16 800 U/g、緩沖液pH 2.97、料液比1∶30、提取時(shí)間21.32 h，在此工藝條件下，得到馬面魚皮膠原蛋白的提取率為27.9%，考慮到實(shí)際操作的便利性，將最佳工藝條件修正為加酶量16 800 U/g、緩沖液pH 3.0、料液比1∶30、提取時(shí)間21.5 h。為驗(yàn)證模型分析的準(zhǔn)確性，在修正后的工藝條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，做3 次平行，結(jié)果取平均值，得到馬面魚皮膠原蛋白的提取率為27.6%，與模型預(yù)測(cè)值相差0.014%，說明該模型可以較好地反映胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白工藝條件的影響，且用Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白的工藝優(yōu)化是可行的。

2.3 膠原蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 氨基酸分析

表4 馬面魚皮膠原蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of collagen from Thamnaconus modestus skin

一般膠原蛋白都由18 種不同氨基酸組合而成。從表4可以看出，馬面魚皮的胃蛋白酶提取產(chǎn)物中，含有18 種氨基酸，其中必需氨基酸有8 種，占總氨基酸含量的30.48%，缺少色氨酸，甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和胱氨酸含量較低，甘氨酸含量最高，約占總氨基酸含量的19.64%，同時(shí)脯氨酸、羥脯氨酸含量也較高，分別占總氨基酸含量的8.69%、6.82%，據(jù)楚水晶[9]報(bào)道膠原蛋白中含有18 種氨基酸，缺少色氨酸，大部分膠原蛋白特征芳香氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸）和胱氨酸含量較少，同時(shí)含有大量的脯氨酸和羥脯氨酸，其中脯氨酸含量一般應(yīng)高于羥脯氨酸含量。馬面魚皮的胃蛋白酶提取產(chǎn)物中，氨基酸的組成成分與膠原蛋白的接近，且含量相似，據(jù)此可推斷，馬面魚皮的胃蛋白酶提取產(chǎn)物可能為膠原蛋白。

2.3.2 紫外光譜分析

圖6 馬面魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜Fig. 6 UV absorption spectrum of collagen from T. modestus skin

由圖6可知，胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白在220 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，而在280 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收峰，說明提取的膠原蛋白純度較高[14]。實(shí)驗(yàn)所測(cè)和黃石溪[15]所測(cè)草魚I型膠原蛋白吸光特性一致。膠原蛋白所含的—C＝O、—COOH、CO—NH2等生色基團(tuán)在225 nm波長(zhǎng)附近對(duì)紫外光有較大吸收，本實(shí)驗(yàn)所提膠原蛋白在220 nm波長(zhǎng)處吸收最大，這與報(bào)道膠原蛋白的紫外吸收特征相一致[16-17]。芳香族氨基酸在250～290 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收，但根據(jù)膠原蛋白氨基酸組成可知，芳香族氨基酸，如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸含量并不多，但吸收有所增強(qiáng)，其中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分別在257、275、280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，所測(cè)結(jié)果符合3 種氨基酸吸收特性[18-20]。

2.3.3 紅外光譜分析

圖7 馬面魚皮膠原蛋白的紅外光譜圖Fig. 7 Infrared spectrum of the collagen

由圖7可知，3 412.8 cm-1附近為酰胺A帶的N—H伸縮振動(dòng)峰，證明氫鍵的存在[21-23]，2 925.2 cm-1附近為膠原蛋白酰胺B帶的C—N伸縮振動(dòng)峰，膠原蛋白的高頻酰胺A、B帶直接與其超螺旋的三股螺旋構(gòu)型相關(guān)[27]。1 650.4 cm-1附近為酰胺I帶的C＝O伸縮振動(dòng)峰，也是α螺旋的COOH—反對(duì)稱收縮振動(dòng)峰，膠原蛋白的酰胺II帶出現(xiàn)在1 530.7、1 438.2、1 370.8 cm-1處，它是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)、CH2彎曲、COO—對(duì)稱伸縮共同引起的[24-29]，1 080.2 cm-1附近為酰胺IV帶的C＝N伸縮振動(dòng)峰。膠原蛋白紅外吸收光譜與詹永獻(xiàn)[26]所測(cè)草魚鰾膠原蛋白紅外吸收一致。出現(xiàn)1 650.4、1 080.2 cm-1和1 438.2 cm-1三個(gè)明顯的吸收峰，分別位于酰胺I、酰胺IV帶和酰胺II帶的出峰位置，與文獻(xiàn)中報(bào)道的鯉魚皮膠原蛋白[24]、狹鱈魚皮膠原蛋白[25]進(jìn)行比較，表明馬面魚皮膠原蛋白具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3.4 SDS-PAGE分析

圖8 馬面魚皮膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 8 SDS-PAGE profile of the collagen

由圖8可知，馬面魚皮所提膠原蛋白有α1（α2）、β、γ鏈組成，α鏈分子質(zhì)量在110～150 kDa之間，β、γ鏈分子質(zhì)量在200 kDa以上，符合I型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征，與文獻(xiàn)[29-32]所測(cè)一致。電泳圖譜無(wú)雜帶，可見所提膠原蛋白純度較高。

3 結(jié) 論

通過試驗(yàn)優(yōu)化得到胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白最佳條件為胃蛋白酶加酶量16 800 U/g、緩沖液pH 3.0、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間21.5 h，提取率為27.6%。同時(shí)對(duì)所提膠原蛋白進(jìn)行氨基酸分析，紫外和紅外光譜分析，SDS-PAGE分析，結(jié)果表明所提馬面魚皮膠原蛋白紫外最大吸收峰為225 nm，在1 650.4、1 080.2 cm-1處出現(xiàn)酰胺I、酰胺IV帶和酰胺II帶的紅外吸收峰，含有α1（α2）、β、γ鏈，符合I型膠原蛋白特征，保留了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。