應(yīng)用高通量測序法檢測南疆傳統(tǒng)酸奶中微生物多樣性

瑪依樂·艾海提，西熱娜依·阿布力克木，努爾古麗·熱合曼*

（新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054）

新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族長久以來保持飲食發(fā)酵酸奶的好習(xí)慣，傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶是最常見的自制乳制品之一，富含多種必須的維生素、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等。傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶具有獨(dú)特并穩(wěn)定的微生物群落，具有地區(qū)差異性，長期以來所形成的習(xí)慣、氣候的不同等原因引起了酸奶微生物種類的差異。

高通量測序技術(shù)是以一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定為標(biāo)志。高通量454焦磷酸測序技術(shù)為微生物生態(tài)領(lǐng)域提供了更準(zhǔn)確地識別微生物類群的信息，包括難培養(yǎng)微生物[1-2]；對于不同的研究對象該測序技術(shù)不僅為提供了大量數(shù)據(jù)，而且全面證實(shí)了研究對象所含微生物的多樣性[3]。近幾年來高通量測序技術(shù)在乳制品行業(yè)里廣泛應(yīng)用，徹底克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)及分子鑒定方法的不足，為乳制品微生物群落組成提供更準(zhǔn)確和詳細(xì)的理解，并在優(yōu)良微生物資源開發(fā)和食品安全方面作出了巨大的貢獻(xiàn)[4-5]，雖然高通量焦磷酸測序法無法識別樣品中活和死的微生物，但是該方法有一定的應(yīng)用前途[6]。第2代測序技術(shù)最具有代表性的是Roche公司的454焦磷酸測序技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)，454焦磷酸測序技術(shù)目前應(yīng)用最廣泛[7-8]。

前人在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)微生物，并利用分子鑒定方法對新疆部分地區(qū)傳統(tǒng)酸奶進(jìn)行了多樣性研究，傳統(tǒng)研究微生物生態(tài)學(xué)的方法基本上都局限于用固體培養(yǎng)基分離微生物[9]。然而，隨著鑒定技術(shù)的發(fā)展，更多的研究表明，每一培養(yǎng)基都具有選擇性，因此在一定程度上低估了生物環(huán)境中微生物種類，而且從固體培養(yǎng)基分離出來的菌落再一次降低了微生物被鑒定的可能性。

本研究采用高通量454焦磷酸測序技術(shù)對來自于新疆阿圖什及烏什的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中微生物類群進(jìn)行了分析，探討新疆部分地區(qū)酸奶中微生物多樣性，從而彌補(bǔ)了微生物在挑菌落不全面、沒有真正顯示出微生物類群的漏洞。本研究不僅為保護(hù)我國傳統(tǒng)乳制品中優(yōu)良菌株資源，而且能為今后傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年12月分別來自于居住在新疆阿圖什、烏什等地區(qū)的農(nóng)民家庭采集的4 份樣品：1號樣品來自于阿圖什阿湖鄉(xiāng)光明村544號，3號樣品來自于阿圖什上阿圖什鄉(xiāng)拉依力克村吐喀其拉路2號，4號樣品來自于阿圖什上阿圖什拉依力克村阿圖什路514號，7號樣品來自于阿克蘇烏什縣阿克托海鄉(xiāng)阿克托海村3組23號家庭。采樣時(shí)利用無菌吸管把樣品吸取并立刻裝入50 mL的無菌離心管中，用封口膜緊密地包裝并立即裝在冰袋中立刻運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[10]。

膠回收試劑盒 上海生工生物公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用酶 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳槽、離心機(jī)、冰箱、LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；光學(xué)顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫干燥箱 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的培養(yǎng)

用0.85%的無菌生理鹽水將樣品按稀釋涂布法進(jìn)行梯度稀釋并將10-5、10-6、10-7稀釋度的稀釋液分別涂布于改良MRS、Lee氏等培養(yǎng)基（37 ℃）、YGC瓊脂平板（28 ℃）培養(yǎng)48 h[11]。最后用無菌水沖洗平板并保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[12]。平板沖洗液編號及對應(yīng)的培養(yǎng)基具體信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information about the microbial samples

1.3.2 總DNA提取

分別取4 份樣品平板洗液2 mL置于離心管中振搖確保樣品充分混合，12 000 r/min離心5 min棄去上清液，懸浮于1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8），12 000 r/min離心10 min，該過程重復(fù)3 次[13]。細(xì)胞顆粒上加567 μL TE緩沖液和100 μL溶菌酶后懸浮，并在37 ℃加熱1 h。再加入60 μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液（10%）、10 μL蛋白酶K，置于37 ℃水浴2 h，之后添加50 μL NaCl和80 μL十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）-NaCl，在65 ℃加熱30 min。沉淀加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液12 000 r/min離心10 min（離心2 次收集上清液）。上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入等體積氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）溶液，輕輕混合12 000 r/min離心5 min，然后把上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0.1體積的3 mol/L NaAc溶液和2 倍體積的冰冷異丙醇，置于-20 ℃孵育30 min。在12 000 r/min離心2 min后將DNA沉淀，用500 μL 70%乙醇溶液洗滌DNA，并自然干燥[14]。最終純化的DNA溶于50μL TE緩沖液進(jìn)一步應(yīng)用。

1.3.3 PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS區(qū)

以稀釋D N A為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶B a r c o d e引物和高效高保真的酶進(jìn)行P C R[15]。細(xì)菌1 6 S r D N A V 4區(qū)引物為5 1 5 F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和909R（5’-CCCCGYCAA-TTCMTTTRAGT-3’）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃、3 min；94 ℃、40 s，56 ℃、60 s，72 ℃、60 s，共循環(huán)30 次；72 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增體系：基因組模板DNA 2 μL，2×Easy TaqTMPCR SuperMix 12.5 μL，引物27F 0.5 μL，引物1495R 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

真菌ITS擴(kuò)增區(qū)引物為ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和gITS7F（5’-GTGART- CATCGART CTTTG-3’）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，68 ℃、45 s，共循環(huán)34 次；72 ℃、10 min[16]。PCR擴(kuò)增體系：引物NL1 1.5 μL，引物NL2 1.5 μL，Super Mix 12.5 μL，基因組模板DNA 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測對目的條帶使用上海生工公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，并用Nanodrop進(jìn)行濃度和質(zhì)量的測定。

1.3.4 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，文庫合格后，使用v2測序試劑盒（2×250 bp）和MiSeq測序儀進(jìn)行上機(jī)測序[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和真菌的序列豐度及多樣性分析

常見的Alpha多樣性指數(shù)有Shannon多樣性指數(shù)、Chao1豐富度指數(shù)、Observed species（即某個(gè)測序深度下觀察到的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數(shù)目、Simpson指數(shù)等。本研究中所得到的Alpha多樣性指數(shù)及序列信息參見表2。通過測序，拼接得到的細(xì)菌原始序列為211 965 條，質(zhì)量控制后的有效序列為206 696 條；拼接得到的真菌原始序列為305 252 條，質(zhì)量控制后的有效序列為293 677 條。該序列根據(jù)97%相似性度水平進(jìn)行OTU劃分及嵌合體檢查等方面需要深度分析。

表2 3 種培養(yǎng)基上可培養(yǎng)微生物Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity values of culturable microbes from naturally fermented milk on the three media

2.2 稀釋曲線

圖1 細(xì)菌稀釋性曲線Fig. 1 Rarefaction curves of bacteria

圖2 真菌稀釋性曲線Fig. 2 Rarefaction curves of fungi

稀疏曲線可根據(jù)比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣品中物種的豐富度，說明測序數(shù)據(jù)量是否合理、測序深度是否可靠地表現(xiàn)出微生物組成[17]。稀釋曲線趨于平坦說明測序深度合理以及更多的測序量會產(chǎn)生新的OTU；從圖1可以看出，樣品AM3、AL3、AY3的稀釋曲線在小于12 000序列的條件下均沒有進(jìn)入平臺期，假如繼續(xù)增加測序量，OTU數(shù)量也會隨著增加。其他樣品（AM1、AM4、AL4、AY4、UY7、UM7）的測序量大于7 500序列時(shí)基本滿足樣品中細(xì)菌豐富度。

由圖2可以得出，AM3、AY3、UY7、AM1樣品稀釋曲線沒有趨于平臺期，隨測序深度的增加也可以出現(xiàn)新的OTU，其他幾個(gè)樣品（AY1、AL3、AM4、AL4、AY4）的稀釋曲線到5 000序列為止已進(jìn)入平緩狀態(tài)，此結(jié)果表明測序深度已足夠反映出樣品中真菌含量。

2.3 細(xì)菌和真菌的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）

PCoA是將聚類分析與主成分分析方法結(jié)合起來，用較少的主坐標(biāo)對分類單元進(jìn)行有效地排序。在16S rRNA基因序列分析中，普遍使用基于Unifrac距離的PCoA分析，若樣本組成越相似反映在PCoA圖中的距離越近[18]。UniFrac是通過計(jì)算序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上的進(jìn)化距離，進(jìn)而比較不同微生物群落間結(jié)構(gòu)差異的一種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化方法[19]。

圖3 細(xì)菌基于加權(quán)Unifrac距離的PCoA圖Fig. 3 PCoA of bacterial diversity

圖4 真菌基于加權(quán)Unifrac距離的PCoA圖Fig. 4 PCoA of fungi diversity

由圖3可知，4 份樣品在3 種培養(yǎng)基（MRS、YGC、Lee 氏培養(yǎng)基）上細(xì)菌豐富度均獨(dú)立，沒有出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，可說明在3 種培養(yǎng)基上4 份樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著的差異。從圖4可知，AM1、AM3、UM7相互重疊，可說明1、3、7號樣品在MRS培養(yǎng)基上的真菌群落相似。AY1、AY3、UY7、AY4沒出現(xiàn)重疊，可說明1、3、4、7號樣品在YGC培養(yǎng)基上真菌群落組成相互獨(dú)立。而AL3、AL4完全分離。

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

為探索被測樣品物種多樣性信息，對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%的序列相似性將序列聚類成為OTU再深度分析[20]。如表3所示，在16S rRNA門水平上九個(gè)樣本共檢測到15 個(gè)菌門，厚壁菌門是絕對優(yōu)勢菌門，占據(jù)94.6%～99.92%，其次是變形菌門占據(jù)0.028%～9.38%。1號樣品（AM1）相對含量由大到小為99.38%厚壁菌門、0.175 8%變形菌門，其他門豐度小于0.1%。3號樣品在MRS及Lee氏培養(yǎng)基上（AM3、AL3）厚壁菌門相對含量均為 99.86%，YGC培養(yǎng)基上（AY3）占優(yōu)勢的為厚壁菌門90.49%，其次為變形菌門9.38%，其他門相對含量小于0.02%。4號樣品MRS及Lee氏培養(yǎng)基上（AM4、AL4）厚壁菌門相對含量分別為99.92%、99.51%，除變形菌門外其他門相對含量小于0.1%；YGC培養(yǎng)基上（AY4）占有97.26%的厚壁菌門、1.88%的變形菌門和0.007%的Euryarchaeota，其他門相對含量小于0.77%。7號樣品MRS培養(yǎng)基（UM7）中厚壁菌門為99.82%，其他門相對含量小于0.08%；YGC培養(yǎng)基（UY7）有占94.6%的厚壁菌門、4.881%變形菌門，其他門相對含量小于0.04%。由以上數(shù)據(jù)可看出，4 份樣品在3 種培養(yǎng)基上厚壁菌門為絕對優(yōu)勢菌門，相對含量最高，而AY3里的變形菌門含量相比其他樣品較多。在AY4中發(fā)現(xiàn)含量較多的放線菌門。

表3 在門水平上樣品中細(xì)菌相對含量（序列所占比例）Table 3 Relative abundance of bacteria in each sample at phylum level%

圖5 細(xì)菌累積圖（屬水平）Fig. 5 Relative abundance of bacteria at genus level

9 個(gè)樣品中共測出40 個(gè)菌屬，其中乳酸菌及鏈球菌為優(yōu)勢菌（圖5）。1號樣品在MRS培養(yǎng)基（AM1）上乳桿菌屬（Lactobacillus）為絕對優(yōu)勢菌。3號樣品在MRS培養(yǎng)基上（AM3）優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（92.99%），其次為占6.685%的鏈球菌屬（Streptococcus）；Lee氏培養(yǎng)基上（AL3）優(yōu)勢菌屬為鏈球菌（54.96%）屬，其次為乳桿菌屬（39.18%）；YGC培養(yǎng)基上（AY3）除占90.22%的乳桿菌屬外，還有占9.262%的醋酸桿菌屬（Acetobacter）。4號樣品AM4、AL4及AY4里未鑒定屬均占優(yōu)勢。7號樣品在MRS培養(yǎng)基上（UM7）優(yōu)勢菌屬為鏈球菌屬（66.32%）,其次為乳桿菌屬；YGC培養(yǎng)基上UY7大多數(shù)為未鑒定均屬，還有少量的醋酸桿菌（7.789%）。

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

表4 在門的水平上樣品中真菌相對含量（序列所占比例）Table 4 Relative abundance of fungi in each sample at phylum level%

基于ITS測序門水平，10 個(gè)樣本中共檢測到6 個(gè)門，具體數(shù)據(jù)見表4。1號樣品在MRS培養(yǎng)基（AM1）真菌組成成分中以子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門為主，相對含量分別為65.68%、18.87%、10.23%；YGC培養(yǎng)基上（AY1）子囊菌門（99.98%）為絕對優(yōu)勢門。3號樣品在MRS培養(yǎng)基上（AM3）真菌以子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門為主，相對含量分別為72.67、17.08、5.404%；Lee氏培養(yǎng)基（AL3）上真菌主要是子囊菌門（99.97%）；YGC培養(yǎng)基上（AY3）有99.69%子囊菌門和少量的擔(dān)子菌門（0.216%）。4號樣品在MRS、YGC、Lee氏培養(yǎng)基（AM4、AY4、AL4）上子囊菌門是絕對優(yōu)勢真菌，相對含量分別為99.43%、79.7%、98.21%；Lee氏培養(yǎng)基上還有13.74%擔(dān)子菌門、3.536%接合菌門。7號樣品MRS培養(yǎng)基上（UM7）以66.33%子囊菌門，19.59%擔(dān)子菌門，8.879%接合菌門為主；YGC培養(yǎng)基上（UY7）以99.74%子囊菌門和少量的擔(dān)子菌門為主。由以上數(shù)據(jù)可看出子囊菌門為優(yōu)勢菌門。

基于ITS序列分析在3 種培養(yǎng)基上真菌屬水平的組成具體信息參圖6。1號樣品在MRS培養(yǎng)基（AM1）蠟殼耳屬（Sebacina）較多，其次為被孢霉屬（Mortierella）、曲霉菌屬（Aspergillus）、念珠菌屬（Candida）、鏈格孢屬（Alternaria）等；YGC培養(yǎng)基上（AY1）優(yōu)勢菌屬為酵母菌屬（Saccharomyces）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces），相對含量分別為75.35%、24.26%。3號樣品在MRS培養(yǎng)基（AM3）真菌里蠟殼耳屬較多，其次為被孢霉屬、曲霉菌屬、念珠菌屬、鏈格孢屬；YGC培養(yǎng)基上（AY3）優(yōu)勢菌酵母菌屬為52.75%，其次為克魯維酵母屬45.65%；Lee氏培養(yǎng)基上（AL3）里克魯維酵母屬占5.95%，其次為41.93%酵母菌屬。4號樣品MRS培養(yǎng)基（AM4）酵母菌屬為絕對優(yōu)勢菌屬占97.19%，還有微量的Mycocentrospora屬；Lee氏培養(yǎng)基上（AL4）里酵母菌屬較多，其次為蠟殼耳屬和被孢霉屬、曲霉菌屬等。AY4里酵母菌屬為優(yōu)勢菌屬占87.92%，其次為念珠菌屬。7號樣品MRS培養(yǎng)基（UM7）里蠟殼耳屬和被孢霉屬較多，還有少量的曲霉菌屬、念珠菌屬等；YGC培養(yǎng)基上（UY7）酵母菌屬和克魯維酵母屬優(yōu)勢菌分別占60.06%和38.26%。

圖6 真菌累積圖（屬水平）Fig. 6 Relative abundance of fungi at genus level

3 討 論

本研究采用高通量焦磷酸測序技術(shù)對3 份阿圖什和1 份烏什傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶（MRS、YGC及Lee氏固體培養(yǎng)基上）中的微生物類群進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在細(xì)菌水平上，4 份樣品中厚壁菌門和變形菌門占絕對優(yōu)勢，其中乳桿菌屬、鏈球菌屬、醋酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬的含量較多；在真菌水平上，樣品中子囊菌門和但子菌門占絕對優(yōu)勢，其中阿圖什酸奶中酵母菌屬的含量比烏什酸奶高，但是烏什酸奶中克魯維酵母屬的含量比阿圖什酸奶較高。綜上所述，厚壁菌門和子囊菌門在各樣品中占絕對優(yōu)勢，擔(dān)子菌門、接合菌門和變形菌門等在每一個(gè)樣品中都存在，但含量較少?；贛RS和Lee氏培養(yǎng)基上微生物的種類及其含量有差異，在MRS培養(yǎng)基上低豐富度的乳桿菌屬占優(yōu)勢，在Lee氏培養(yǎng)基上低豐富度的鏈球菌屬占優(yōu)勢，在YGC培養(yǎng)基上酵母菌屬比克魯維酵母屬占優(yōu)勢。

諸多學(xué)者對乳制品中的微生物多樣性進(jìn)行研究，基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，鑒定出新疆酸奶中乳桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬[21-23]；利用MRS培養(yǎng)基對新疆不同地區(qū)酸奶中的優(yōu)勢乳桿菌屬進(jìn)行分離鑒定[24-26]。智楠楠等[27]利用高通量測序技術(shù)，對從市場購買的9種酸奶樣品進(jìn)行微生物多樣性研究，測定結(jié)果表明：酸奶中優(yōu)勢菌為厚壁菌門，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定共同性的同時(shí)也存在一定的差異。

本研究結(jié)果中微生物多樣性特征與其他學(xué)者研究結(jié)果大體相同，但微生物種類及其數(shù)量上具有差異。兩個(gè)地區(qū)的酸奶樣品中微生物類群在數(shù)量、種類等方面具有一定的差異，這可能是以下幾個(gè)原因而引起的：采樣地區(qū)的地理位置、氣候、農(nóng)民制作酸奶的方法、制作工藝（如接種量、接種溫度、發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵溫度、使用的容器等）、飲食習(xí)慣等客觀因素的不同引起酸奶濃度及其成分的不同，因此不同地區(qū)酸奶中的微生物多樣性具有一定的差異[28]。

本實(shí)驗(yàn)中存在未測定微生物可能是因?yàn)楹昊蚪M測序數(shù)據(jù)中包含著未知數(shù)量的多個(gè)物種，所以很難確定一段DNA序列來源于何種物種，拼接時(shí)也難以判斷何種DNA序列片段應(yīng)該拼接到一起[29]。本課題組僅研究了4 份樣品在3 種培養(yǎng)基上的微生物多樣性，對所培養(yǎng)出的微生物組成進(jìn)行分析，雖然有一定的局限性，但是也能在一定程度上反映出4 份傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中微生物群落。