原發(fā)性血小板增多癥患者鈣網(wǎng)蛋白基因突變及其與臨床療效的相關(guān)性

丁 莉，王 季，唐君玲，馬 濤，湯計(jì)瑞，朱小鳳，王雪梅，李曉明

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，四川瀘州 646000)

原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)是一類以骨髓巨核細(xì)胞系終末分化細(xì)胞及外周血血小板增多為主要表現(xiàn)的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。臨床可無(wú)癥狀或有血管舒縮功能障礙相關(guān)表現(xiàn)，有發(fā)生動(dòng)靜脈血栓、出血、進(jìn)展為骨髓纖維化或急性白血病的風(fēng)險(xiǎn)。既往的研究表明50%～60%的ET患者具有JAK2V617F突變，近年的研究發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CALR)基因第9號(hào)外顯子突變存在于70%～80%的JAK2V617F突變陰性ET患者中[1]。有研究表明CALR基因突變常與更高的血細(xì)胞負(fù)荷及血栓事件相關(guān)[2]，但目前關(guān)于CALR基因突變是否影響ET患者臨床療效的相關(guān)報(bào)導(dǎo)尚少見，故本研究旨在檢測(cè)ET患者CALR基因的突變情況，評(píng)價(jià)其與ET患者臨床療效的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年12月至2017年6月就診于本科室確診為ET的61例患者(均已行JAK2V617F突變檢測(cè))，診斷標(biāo)準(zhǔn)及危險(xiǎn)分層參照WHO2008診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。其中JAK2V617F突變陽(yáng)性(+)26例(男14例，女12例；年齡18～79歲)，JAK2V617F突變陰性(-)35例(男16例，女19例；年齡21～83歲)。收集35例JAK2V617F(-)患者骨髓或外周血標(biāo)本，檢測(cè)其 CALR基因第9號(hào)外顯子的突變情況。上述患者接受臨床常規(guī)方案治療，回顧性分析其臨床資料，評(píng)估疾病緩解情況。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1CALR基因第9號(hào)外顯子突變檢測(cè) (1)在患者知情同意情況下，抽取患者骨髓或外周血EDTA抗凝標(biāo)本約3 mL，提取全基因組DNA (DNA提取試劑盒由天根生化科技有限公司生產(chǎn))，使用無(wú)菌去離子水將其稀釋至終濃度 200 μg/mL。(2)PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)。CALR基因9號(hào)外顯子目標(biāo)片段PCR引物由上海Invotrogen生物技術(shù)有限公司合成(正向引物5′-CTG GCA CCA TCT TTG ACA ACT T-3′；反向引物5′-GGC CTC TCT ACA GCT CGT C-3′)。反應(yīng)體系25 μL：其中Taq 酶混合液12.5 μL(Takara 公司產(chǎn)品)、上下游引物各1.0 μL、去離子水8.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃ 2 min;94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)總循環(huán)；72 ℃延伸1 min。(3)PCR產(chǎn)物檢測(cè)：使用2%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物的樣本剩余部分送Invitrogen公司純化后，使用ABI3730DNA 測(cè)序儀 (美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司) 進(jìn)行雙向測(cè)序。檢測(cè)到突變的樣本進(jìn)一步送作克隆測(cè)序。

1.2.2危險(xiǎn)分層標(biāo)準(zhǔn)[3](1)低危組：年齡小于60歲，無(wú)心血管疾病高危因素(如吸煙、肥胖、高血壓、糖尿病、高血脂等)，無(wú)血栓或栓塞病史。(2)高危組：年齡大于或等于60歲，且(或)有血栓或栓塞病史。 (3)中危組：介于低危與高危組之間。

1.2.3治療方案 所有入組患者：當(dāng)血小板計(jì)數(shù)大于或等于1 000×109/L時(shí)聯(lián)合血小板單采，同時(shí)輔以羥基脲口服輔助降細(xì)胞以減小栓塞風(fēng)險(xiǎn)(據(jù)初治時(shí)血小板具體計(jì)數(shù)、年齡來(lái)確定起始劑量15～20 mg·kg-1·d-1)。當(dāng)血小板計(jì)數(shù)小于1 000×109/L時(shí)，低危組及中危組患者單用重組人干擾素α2b(IFN-α2b，北京凱因益生公司)60 μg/d皮下注射(注射前0.5 h口服奈普生預(yù)防流感樣不良反應(yīng))，血小板降至正常上限開始減量為每2天1次，緩解后逐步減量至1～2次/周維持；高危組患者在使用干擾素(方案同上)時(shí)繼續(xù)聯(lián)合羥基脲輔助降細(xì)胞至安全范圍(血小板降至600×109/L左右)后單用干擾素，血小板降至正常上限開始減量為每2天1次，緩解后逐步減量至1～2次/周維持。

1.3療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 完全緩解：臨床癥狀消失，血象 (白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板)恢復(fù)正常。部分緩解：血細(xì)胞計(jì)數(shù)較治療前下降50%，臨床表現(xiàn)有所減輕。治療無(wú)效：達(dá)不到部分緩解者[4]。

2 結(jié) 果

2.1PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序結(jié)果 CALR基因野生型樣本PCR目標(biāo)產(chǎn)物長(zhǎng)度377 bp，突變型長(zhǎng)度則不等于377 bp。突變型電泳后可見雙條帶或較厚重模糊的單條帶，提示混合型產(chǎn)物(圖1所示)。PCR產(chǎn)物剩余部分送雙向測(cè)序。35例JAK2V617F(-)患者中共檢出18例(51.4%)CALR基因突變。包含3種類型：1型(52 bp缺失)15例(42.8%)、2型(5 bp插入)2例(5.7%)、3 bp缺失1例(2.9%)。測(cè)序提示存在突變的樣本進(jìn)一步送克隆測(cè)序，3 bp缺失型未克隆成功。

1、 2：野生型產(chǎn)物。3、5、6、7：野生型及52 bp缺失型混合產(chǎn)物；4、8:野生型及5 bp插入型混合產(chǎn)物；9：DNA分子標(biāo)記物圖1 部分樣本PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.2ET患者臨床特征及血液學(xué)療效分析 JAK2V617F(+)、CALR(+)、JAK2V617F及CALR雙陰性患者分別設(shè)為A、B、C組，各組間性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組ET患者，初診時(shí)年齡常較其余兩組年輕化，同時(shí)危險(xiǎn)度分層相對(duì)較低(P<0.05)。經(jīng)常規(guī)臨床治療后，較多的A、B組患者能獲得不同程度血液學(xué)緩解，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)兩組患者的總緩解率均較C組患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討 論

ET屬于BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤(classic myeloproliferative neoplasm，MPN)范疇。導(dǎo)致MPN的惡性克隆復(fù)雜多樣，其中JAK2、CALR、MPL基因突變被認(rèn)為是MPN發(fā)病的使動(dòng)因素，對(duì)MPN具有診斷意義。CALR已被證實(shí)可對(duì)多種細(xì)胞功能(如蛋白質(zhì)折疊、胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程)造成影響[5]。FALCHI等[6]、MELIKYAN等[7]的研究發(fā)現(xiàn)：ET患者CALR基因突變常與更高的血小板計(jì)數(shù)、更低的血栓事件及更好的總生存相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)CALR基因第9號(hào)外顯子突變?cè)贘AK2V617F陰性的ET患者中檢出率較高(18/35,51.4%) 。其中以1型(52 bp缺失)最多見，占總突變83.3%；其次為2型(5 bp插入)占總突變11.1%；與近期國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相近[8-9]。同時(shí)檢出1例少見的3 bp(AAG)缺失。相較于JAK2V617F(+)及雙陰性的ET患者，CALR(+)的ET患者初診時(shí)年齡更小、危險(xiǎn)度更低，其生存、預(yù)后判斷受高齡伴隨其他疾病所帶來(lái)的影響可能相對(duì)較小。

聯(lián)合羥基脲及干擾素的常規(guī)臨床治療方案能使較多的JAK2V617F(+)及CALR(+)患者獲得完全或部分血液學(xué)緩解，相較于雙陰性患者總緩解率更高，這得益于具有JAK2或CALR基因突變的患者相較于雙陰性患者對(duì)干擾素應(yīng)答更佳。有研究表明單一的JAK2V617F突變[10-11]或CALR突變[12]的細(xì)胞對(duì)干擾素-α可保持持久的敏感性。干擾素α治療紅細(xì)胞增多癥(PV)和ET的多年臨床實(shí)踐已證實(shí)其可清除JAK2V617F突變?cè)煅杉?xì)胞，使患者獲得完全分子生物學(xué)緩解，但部分患者停藥后可在分子學(xué)水平復(fù)發(fā)[13]。大多數(shù)患者僅能通過常規(guī)臨床治療獲得部分血液學(xué)緩解，如何使更多患者獲得完全、持續(xù)的血液學(xué)緩解甚至分子生物學(xué)緩解成為臨床治療的困難之處。

通過本次研究分析得出：CALR基因9號(hào)外顯子突變是ET患者重要分子遺傳學(xué)標(biāo)志之一，此突變影響患者對(duì)臨床治療的應(yīng)答。檢測(cè)ET患者CALR基因突變有助于提高對(duì)該類患者的臨床診斷、預(yù)后判斷及為設(shè)定更加個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)，為更多患者帶來(lái)福音。