血管內(nèi)皮生長因子對兔腹主動脈支架植入后血管內(nèi)皮功能的影響研究??

苗建波，安少波，徐 雷，張曉蕾，胡喜田，吳志紅，都 偉

(石家莊市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科 050011)

冠狀動脈介入術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用顯著改善了冠心病患者總體預(yù)后與生活質(zhì)量，但術(shù)后發(fā)生的支架內(nèi)血栓(stent thrombosis，ST)形成仍是困擾臨床的重要難題[1]。藥物涂層支架的應(yīng)用使支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率明顯降低，而ST形成并未明顯減少。目前，臨床認(rèn)為ST形成的主要機制在于藥物涂層支架導(dǎo)致血管再內(nèi)皮化延遲。因此，加快血管內(nèi)皮化有利于恢復(fù)血管功能，預(yù)防ST形成。既往觀點認(rèn)為，受損血管邊緣內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生是完成血管再內(nèi)皮化的主要途徑[2]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)顯示，起源于骨髓的干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)經(jīng)血管損傷激活后，遷移至損傷血管區(qū)域，參與血管再內(nèi)皮化[3]。有研究表明，粒細(xì)胞集落刺激因子能夠激活EPC，促進(jìn)血管再內(nèi)皮化，但其促炎作用較強，在安全性方面欠缺[4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)亦可通過刺激骨髓作用，激活EPC，從而促進(jìn)血管再內(nèi)皮化，防止術(shù)后ST形成，同時VEGF促炎作用較弱，安全性較高。本研究通過設(shè)計隨機對照實驗，觀察VEGF對新西蘭兔腹主動脈支架植入后血管內(nèi)皮再生速率及血管內(nèi)皮功能的恢復(fù)，旨在為減少支架植入術(shù)后ST形成等并發(fā)癥的發(fā)生提供新的靶點與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康新西蘭白兔35只，雄性，年齡4～6個月，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，購自四川動物養(yǎng)殖中心。

1.1.2實驗儀器與試劑 苦味酸固定液：將1.2 g苦味酸加至100 mL蒸餾水內(nèi)，使溶液形成飽和狀態(tài)；改良蘇木精染液：蘇木精0.25 g、硫酸鋁鉀0.5 g、碘酸鈉25 mg、冰醋酸1 mL、甘油15 mL、無水乙醇2 mL、蒸餾水33 mL；1%鹽酸-乙醇分化液：45.5 mL 70%乙醇、0.5 mL濃酸鹽；促藍(lán)液：硫酸鎂與碳酸氫銨分別2.00、0.35 g，蒸餾水100 mL。恒溫箱、二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、光學(xué)顯微鏡、天平等。

1.1.3實驗飼料 高脂飼料，含15%蛋黃粉、0.5%膽固醇、5%豬油、79.5%普通飼料。

1.2 方法

1.2.1建立高脂血癥動物模型 分籠飼養(yǎng)新西蘭兔，觀察7 d后，抽取兔靜脈血，檢測總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等各項血脂指標(biāo)，完成各項測定后，開始喂養(yǎng)高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)3周，剔除高脂飼料中膽固醇，繼續(xù)喂養(yǎng)至6周后，復(fù)查血脂水平。

1.2.2組織形態(tài)學(xué)分析 處死新西蘭兔5只，取其腹主動脈切片觀察脂質(zhì)沉積與動脈硬化程度。將腹主動脈置于苦味酸飽和溶液中固定，采用乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，制作石蠟塊，連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察動脈粥樣硬化斑塊。

1.2.3實驗動物分組 采用隨機數(shù)字表法將余下30只新西蘭兔分為兩組：裸金屬支架組、裸金屬支架+VEGF組，各15只。

1.2.4支架植入 兩組實驗動物均植入裸金屬支架，在動物導(dǎo)管室進(jìn)行所有操作，確保無菌操作流程。術(shù)前3 d開始喂服阿司匹林(山西新寶源制藥有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H14020945)，25 mg/d；氯吡格雷(深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H20000542)，75 mg/d。經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(上海新亞藥業(yè)有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H31021725)1 mL/kg，麻醉完成后，將兔固定于操作臺上，將其腿部毛褪去。應(yīng)用聚維酮碘與75%乙醇脫碘消毒腿部皮膚，于消毒區(qū)域鋪巾，鋪巾范圍小于消毒區(qū)域，作為手術(shù)視野。抽取2 mL利多卡因(紫光古漢集團(tuán)衡陽制藥有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H43021924)，局部浸潤麻醉。將兔腿部皮膚切開，逐層分離，顯露右股動脈，行穿刺針穿刺，見回血噴射后，置入導(dǎo)引鋼絲，并于腹主動脈內(nèi)送入6 F引導(dǎo)管。經(jīng)引導(dǎo)管予以100 U/kg肝素鈉，透視條件下，鋼絲進(jìn)入腹主動脈，注意避開腎動脈分叉，沿鋼絲進(jìn)入造影導(dǎo)管，做腹主動脈造影，測量血管直徑，確定目標(biāo)血管，造影結(jié)束后將造影導(dǎo)管撤出。采用3.5 mm直徑的球囊攜帶支架植入腹主動脈，球囊支架與血管直徑比為1.1～1.2∶1.0。將球囊充盈至8 atm，維持10 s，待支架與血管壁完全貼合后，將球囊撤出，造影觀察血管，血管通暢，無影像學(xué)異常后，將造影管與鞘管退出，嚴(yán)格止血、逐層縫合傷口，用碘酒消毒皮膚。兔清醒后，送至籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。術(shù)后常規(guī)肌內(nèi)注射800 kU青霉素(天津華津制藥有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H12021258)，2次/天，共注射3 d。

1.2.5應(yīng)用VEGF 裸金屬支架+VEGF組植入支架后，即刻經(jīng)導(dǎo)管予以40 μg VEGF121，隨后于術(shù)后第2～9、16～23、31～38天，經(jīng)皮下應(yīng)用VEGF121，1 μg/d。裸金屬支架組注射等劑量與頻率的生理鹽水。

1.2.6檢測外周血EPC 所有實驗動物手術(shù)前均經(jīng)耳緣靜脈取2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用密度梯度離心法將單個核細(xì)胞分離，收集細(xì)胞1×106個重懸于100 μL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加至流式管內(nèi)，同時加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD34與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD45各20 μL，用于同型對照。另一流式管內(nèi)，加抗凝血100 μL、FITC標(biāo)記的IgG120 μL、PE標(biāo)記的IgG120 μL。4 ℃下避光孵育，洗滌，根據(jù)說明書要求上機，流式檢測外周血中CD34+/CD45+的EPC百分率，計數(shù)EPC。

1.2.7檢測血管再內(nèi)皮化速率 分別于術(shù)后15、30、60 d，由各組中隨機選出新西蘭兔5只，將其處死。取支架覆蓋段腹主動脈，包括相鄰上下血管段5 mm，橫向剪開支架植入段血管，平均分為兩段，其中一段以4%多聚甲醛固定，行脫水、透明、石蠟包埋處理，隨后進(jìn)行HE染色，對內(nèi)膜增生程度進(jìn)行觀察；另一段采用2%戊二醛溶液浸泡、固定，應(yīng)用梯度乙醇脫水，經(jīng)臨界點干燥與鍍膜，在電鏡下掃描觀察血管內(nèi)皮化程度，測算內(nèi)皮覆蓋率。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組術(shù)后1、7、14、28 d EPC數(shù)量與術(shù)后15、30、60 d損傷血管再內(nèi)皮化速率。

2 結(jié) 果

2.1EPC數(shù)量比較 兩組術(shù)后13 d，均出現(xiàn)2只新西蘭兔死亡，15 d時處死5只用于檢測血管再內(nèi)皮化速率。裸金屬支架+VEGF組各時段EPC數(shù)量均明顯高于裸金屬支架組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2損傷血管再內(nèi)皮化速率 15 d后，兩組均出現(xiàn)明顯的血管再內(nèi)皮化，其中裸金屬支架+VEGF組基本完成內(nèi)皮化；30 d后，兩組內(nèi)皮化完成，但裸金屬支架組細(xì)胞形態(tài)仍與正常內(nèi)皮存在較大差異，裸金屬支架+VEGF組細(xì)胞變長，已接近于正常內(nèi)皮層形態(tài)；60 d后，裸金屬支架表面完全覆蓋，但存在纖維狀結(jié)構(gòu)。裸金屬支架+VEGF組血管內(nèi)支架表面未出現(xiàn)變化，提示支架植入30 d后內(nèi)膜損傷過程在已完成，見圖1～3。

表1 兩組EPC數(shù)量比較

A：裸金屬支架組；B：裸金屬支架+VEGF組圖1 術(shù)后15 d兩組損傷血管再內(nèi)皮化程度(×50)

A：裸金屬支架組；B：裸金屬支架+VEGF組圖2 術(shù)后30 d兩組損傷血管再內(nèi)皮化程度(×50)

A：裸金屬支架組；B：裸金屬支架+VEGF組圖3 術(shù)后60 d兩組損傷血管再內(nèi)皮化程度(×50)

3 討 論

EPC在冠狀動脈支架植入引起的血管損傷修復(fù)中的作用報道較少，既往有報道患者行冠狀動脈血管成形術(shù)后，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量在外周循環(huán)中明顯增多，內(nèi)皮細(xì)胞集落形成在24 h內(nèi)增加2～3倍[5]。另外，單純行冠狀動脈造影而未實施冠狀動脈支架植入術(shù)患者內(nèi)皮細(xì)胞集落形成單位無明顯變化，提示內(nèi)皮細(xì)胞集落形成與血管損傷具有一定關(guān)系[5]。以往動物實驗中發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀與辛伐他汀能夠激活血管損傷后EPC，促進(jìn)再內(nèi)皮化，緩解內(nèi)膜增生，但有研究提出，僅有特殊的干細(xì)胞可促進(jìn)再內(nèi)皮化[6]。同時多數(shù)研究表明，粒細(xì)胞集落刺激因子能夠激活EPC，提高再內(nèi)皮化速率，抑制內(nèi)膜增生，但研究的缺陷在于動物模型血管損傷僅由介入導(dǎo)管所致，尚未植入支架，故無法顯示支架植入后再內(nèi)皮化程度[7]。而在以狗為實驗對象的研究中，主動脈移植術(shù)后應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子在促進(jìn)再內(nèi)皮化的同時，內(nèi)膜增生十分明顯，加之粒細(xì)胞集落刺激因子促炎作用顯著，其臨床應(yīng)用安全性受到普遍質(zhì)疑[8]。

本研究選取新西蘭兔腹主動脈支架植入模型作為觀察對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裸金屬支架+VEGF組術(shù)后EPC數(shù)量明顯多于裸金屬支架組，且損傷血管再內(nèi)皮化速率明顯大于裸金屬支架組，提示VEGF在支架植入術(shù)后有助于促進(jìn)EPC活化，加快損傷血管再內(nèi)皮化速率，從而改善血流動力學(xué)。VEGF主要分泌于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞生長與分化不可缺少的因子，其不僅參與胚胎血管形成，在修復(fù)血管生理性損傷、促進(jìn)病理性血管新生中同樣扮演著重要角色[9-11]。冠狀動脈支架植入術(shù)是治療冠心病的主要手段，能夠有效開通狹窄或閉塞動脈，但該術(shù)式面臨的問題是支架植入后，粥樣硬化斑塊受壓縮而破裂，造成血管內(nèi)皮損傷，基底膜顯露，進(jìn)而引起血小板聚集，誘發(fā)血栓形成[12]。另外，血管內(nèi)皮損傷可增加多種細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞過度增殖，造成術(shù)后支架內(nèi)再狹窄。因此，及時修復(fù)血管內(nèi)皮損傷對預(yù)防冠狀動脈支架植入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄十分關(guān)鍵[13]。由于冠狀動脈支架植入術(shù)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致EPC快速增殖、遷移，其中EPC主要見于骨髓，是多能細(xì)胞的一種，在人胚胎血管生成、出生后血管新生及內(nèi)皮損傷修復(fù)等過程中均有參與，當(dāng)機體出現(xiàn)損傷信號時，EPC在損傷信號的誘導(dǎo)下遷移至損傷局部，并逐漸分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生與修復(fù)[14-15]。VEGF由成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)旁分泌機制分泌，而VEGF亦可通過促進(jìn)EPC增殖分化，加速內(nèi)皮生長與修復(fù)。VEGF促內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖的特點如下：(1)VEGF能夠通過肝素結(jié)合位點與硫酸肝素結(jié)合，達(dá)到延長自身作用時間的效果；(2)血管內(nèi)皮細(xì)胞與VEGF二者間可形成正反饋效應(yīng)，進(jìn)而增強VEGF作用[16]；(3)VEGF可通過阻止腫瘤壞死因子α等因子的產(chǎn)生，抑制自身凋亡，從而延長作用時間，實現(xiàn)高效的修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能。故高水平VEGF可顯著加快再內(nèi)皮化過程，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的恢復(fù)，預(yù)防血栓形成[17]；此外，VEGF可對抗超氧化物等多種有害物質(zhì)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞過度增生，避免或減少術(shù)后再狹窄形成。

綜上所述，裸金屬支架聯(lián)合VEGF可明顯增加EPC水平，促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化，有利于局部組織血流灌注，減輕機體組織損傷。