尿毒癥血液透析患者中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)水平與冠狀動脈疾病的關(guān)系

劉娜娜 姜 文

終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較高，大約是一般人群的十倍[1]。越來越多的證據(jù)表明，ESRD患者死亡主要源于心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)和感染并發(fā)癥所造成的機(jī)體免疫功能紊亂[2-3]。而尿毒癥毒素和細(xì)胞因子滯留被認(rèn)為是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥的免疫功能障礙的關(guān)鍵因素，使患者更容易感染與動脈粥樣硬化。有研究指出，盡管在ESRD患者中活化的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，但殺菌能力卻顯著降低，提示或許與中性粒細(xì)胞功能障礙有關(guān)[4]。相反，尿毒癥狀態(tài)的過度激活和凋亡增加會導(dǎo)致低度炎癥、內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡程序，可從死亡的中性粒細(xì)胞中釋放捕殺病原體，是由核酸物質(zhì)和顆粒蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。已有研究證實(shí)，NETs具有促凝、抗凝、抗炎及加重血管內(nèi)皮功能障礙等作用[5]。尿毒癥患者中冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)的發(fā)生與炎癥反應(yīng)、血液高凝狀態(tài)等因素有關(guān)[6]。因此，早期檢測尿毒癥患者中NETs可能對CAD疾病的預(yù)防和治療有重要意義。本研究通過探討尿毒癥血液透析患者中NETs水平與CAD的關(guān)系，為CAD疾病的防治提供臨床循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

資料與方法

1.研究對象 選擇2010年1月至2015年12月,來我院接受血液透析的尿毒癥患者96例。根據(jù)64層螺旋CT檢查結(jié)果將患者分為無CAD發(fā)生組(n=60)和CAD發(fā)生組(n=36)。其中，無CAD發(fā)生組男性35例，女性25例；年齡39～79歲，平均(60.05±10.86)歲。CAD發(fā)生組男性20例，女性16例；年齡42～83歲，平均(65.04±11.25)歲。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，且所有研究對象均知情同意。

2.納入和排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床明確診斷為尿毒癥的長期規(guī)律血液透析；64層螺旋CT(冠狀動脈CTA)檢查確診為CAD；檢查資料完整；由直系親屬知情同意并簽署知情同意書，提供患者的詳細(xì)資料。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有CAD發(fā)生史(不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、冠心病)；伴有心、肝、脾、肺等重要臟器損傷；其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及自身免疫系統(tǒng)疾??；惡性腫瘤；未簽署治療知情同意書。

3.研究方法 抽取患者外周靜脈血5 mL，3 000r/min離心10 min,取上清，置-70℃低溫冰箱保存。血漿復(fù)溫后取100μL，加入PicoGreen熒光染料避光孵育10～20min，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測樣品熒光值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品NETs水平。詳細(xì)詢問、檢測并記錄所有入組患者的臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、嗜酒史、糖尿病史、高血壓史、高血脂史、透析齡、收縮壓、舒張壓、心率等指標(biāo)。抽取患者清晨空腹靜脈血2～10mL，應(yīng)用深圳雷杜公司 RT7200全自動血液分析儀和日本奧林巴斯公司AU2700型全自動生化分析儀檢測各生化指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、尿素氮、血肌酐、白蛋白、尿酸、總膽固醇、C反應(yīng)蛋白、血磷、血漿鈣、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)等。冠狀動脈鈣化積分(coronary artery calcification score，CACS)采用Agatston等及其修正方法計(jì)算[7]，鈣化積分=鈣化灶CT峰值×鈣化面積，鈣化灶條件為鈣化面積>1mm2、CT值>130 Hu。其中，130～200Hu記為1分，200～300Hu記為2分，300～400Hu記為3分，≥400 Hu記為4分。鈣化總積分包括各主要分支(左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈)鈣化灶積分的總和，該過程由智能積分軟件計(jì)算完成。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。NETs水平與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。尿毒癥患者各傳統(tǒng)因素和非傳統(tǒng)因素與CAD的關(guān)系采用單因素、多因素非條件Logistic回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組患者臨床資料比較 兩組患者在年齡、有糖尿病史、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿素氮、血肌酐、總膽固醇、C反應(yīng)蛋白、NETs、透析齡、血磷、鈣磷乘積、收縮壓、PTH、CACS方面差異顯著(P<0.05)，在性別、BMI、有吸煙史、有嗜酒史、有高血壓史、有高血脂史、血紅蛋白、白蛋白、尿酸、血漿鈣、舒張壓方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，CAD發(fā)生組在年齡、有糖尿病史例數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿素氮、血肌酐、TC、C反應(yīng)蛋白、NETs、透析齡、血磷、鈣磷乘積、收縮壓、PTH、CACS方面顯著高于無CAD發(fā)生組(P<0.05，表1)。

表1 兩組患者臨床資料比較

注：1mmHg=0.133kPa

表2 尿毒癥患者各臨床因素與CAD關(guān)系的Lagistic分析結(jié)果

2.尿毒癥患者各臨床因素與CAD的關(guān)系 單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡、有糖尿病史、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿素氮、血肌酐、總膽固醇、C反應(yīng)蛋白、NETs、透析齡、血磷、鈣磷乘積、收縮壓、PTH、CACS與CAD發(fā)生密切相關(guān)(P<0.05)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡、有糖尿病史、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白、NETs、透析齡、CACS與CAD發(fā)生密切相關(guān)(P<0.05，表2)。

3.尿毒癥血液透析患者NETs水平與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NETs水平與年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白、透析齡、CACS呈正相關(guān)(P<0.05，表3)。

表3 尿毒癥血液透析患者NETs水平與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

討 論

巨噬細(xì)胞通常被認(rèn)為是參與動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的主要免疫細(xì)胞。然而，中性粒細(xì)胞作為第一個(gè)對組織損傷作出反應(yīng)的細(xì)胞，其作用越來越受到人們的重視。中性粒細(xì)胞主要參與動脈粥樣硬化的早期階段，并促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的分泌[8]。事實(shí)上，NETs與中性粒細(xì)胞一樣，同樣在小鼠和人的動脈粥樣硬化病變管腔、急性心肌梗死患者的新鮮溶解的血栓標(biāo)本中被發(fā)現(xiàn)[9]。NETs是中性粒細(xì)胞活化時(shí)釋放的網(wǎng)狀物質(zhì)，具有抗炎、促炎、促凝等多種生物活性，并參與多種疾病的病理進(jìn)程。Warnatsch等[10]的研究指出總膽固醇結(jié)晶可觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放NETs，這些NETs可促使巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，激活T細(xì)胞，并增強(qiáng)在動脈粥樣硬化斑塊中免疫細(xì)胞的招募。此外，Warnatsch等的研究還指出NETs可作為引發(fā)血管炎癥的內(nèi)源性毒素。還有研究發(fā)現(xiàn)，NETs含有的細(xì)胞外DNA具有血栓形成效應(yīng)，并且能夠與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生交互作用，作為將炎癥和血栓形成聯(lián)系起來的橋梁，在動脈粥樣硬化的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[11]。

事實(shí)上，與尿毒癥相關(guān)的免疫細(xì)胞功能紊亂已經(jīng)確定為病毒相關(guān)癌癥、感染和腎功能不全患者的危險(xiǎn)因素[12]。動脈粥樣硬化和血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加也可能與尿毒癥相關(guān)的免疫功能紊亂和炎癥反應(yīng)有關(guān)。中性粒細(xì)胞活化可產(chǎn)生豐富的內(nèi)源性毒素NETs和氧化應(yīng)激反應(yīng)，然而，NETs水平與CAD發(fā)生關(guān)系的研究報(bào)道較少。張芳曉等[13]的研究指出，膿毒癥患者NETs水平顯著升高，可作為早期診斷膿毒癥的生物標(biāo)志物。于芹等通過探討NETs在尿毒癥急性冠狀動脈綜合征中的作用，發(fā)現(xiàn)尿毒癥組較健康對照組中NETs水平顯著升高，其水平與血小板呈負(fù)相關(guān)，在尿毒癥急性冠狀動脈綜合征患者中檢測意義巨大[14]。陳本露等[15]通過探討NETs在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中可能存在的作用，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞可能通過網(wǎng)捕死亡形成NETs，NETs水平可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的活動程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，NETs水平與年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白、透析齡、CACS呈正相關(guān)，并指出NETs水平與CAD發(fā)生密切相關(guān)。尿毒癥血液透析患者中NETs促進(jìn)CAD發(fā)生的機(jī)制可能涉及血漿樹突細(xì)胞的自體免疫激活[16]。從機(jī)制上來講，NETs中的DNA和從死亡細(xì)胞中釋放的DNA復(fù)合物與中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的顆粒蛋白能夠刺激血管壁中的血漿樹突細(xì)胞活化并產(chǎn)生強(qiáng)烈的I型干擾素反應(yīng)，從而導(dǎo)致CAD發(fā)生。此外，NETs中的自體DNA成分可以刺激機(jī)體自體免疫激活和雙鏈DNA抗體形成，從而促進(jìn)動脈壁炎癥反應(yīng)及動脈粥樣硬化病變的形成及CAD發(fā)生。NETs水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)，表明NETs所發(fā)揮的促炎生物學(xué)作用較強(qiáng)。NETs中含有的循環(huán)游離DNA成分可以作為免疫原而激活免疫應(yīng)答，進(jìn)而放大機(jī)體的免疫反應(yīng)，發(fā)揮促炎作用[17]。本研究與Kim等研究結(jié)果類似，均表明尿毒癥血液透析患者NETs水平與CAD發(fā)生密切相關(guān)[18]。

本研究存在一定局限性：本研究由于是橫斷設(shè)計(jì)，不能確定NETs水平與CAD發(fā)生的因果關(guān)系；樣本量較少制約本研究結(jié)論的全面性；納入的患者可能未排除其他未知影響因素，對結(jié)論也會造成影響?？傊蚨景Y血液透析患者中NETs在導(dǎo)致CAD發(fā)生的確切機(jī)制及其信號通路方面還需更深入更細(xì)致的研究，但NETs水平與CAD發(fā)生密切相關(guān)，可作為預(yù)測CAD發(fā)生的危險(xiǎn)性因素。