3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯材料促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

李海洋 許士俊 張宏家

心肌梗死是臨床上常見(jiàn)且嚴(yán)重的疾病，心肌細(xì)胞壞死后無(wú)法再生。干細(xì)胞移植能夠通過(guò)分化成損傷部位的細(xì)胞從而達(dá)到治療疾病或者改善預(yù)后的目的。但是，由于細(xì)胞移植后沒(méi)有適宜的載體，細(xì)胞流失、壞死嚴(yán)重，治療效果下降。因此，尋找一種能夠模擬細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境并且可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的載體至關(guān)重要[1]。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)能夠分化成所有三胚層細(xì)胞[2]，具有廣泛的全能性，被大量應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。聚羥基脂肪酸脂(PHA)，3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(PHBHHx)由微生物合成[3]在體內(nèi)能夠自我降解，具有良好生物相容性，前期研究表明由PHBHHx制成的細(xì)胞補(bǔ)片不僅能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相互融合，而且能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[4]，本文通過(guò)將mESC接種到PHBHHx膜上，探討此生物材料對(duì)mESC增殖和分化的影響，為mESC進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療心肌梗死奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料 (1)干細(xì)胞：小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)來(lái)R1干細(xì)胞系。(2)主要試劑：高糖DMEM(Gibco)、5%血清替代品(SR，Gibco)、L-谷氨酰胺(Gibco)、青鏈霉素(Gibco)、絲裂霉素C(Sigma)、1%的非必需氨基酸(Gibco)、0.1mmol/Lβ- 巰基乙醇(Gibco)、基質(zhì)膠(BD Pharmingen)磷酸鹽緩沖液(PBS，Gibco)、明膠、0.05% 胰酶(Gibco)。(3)主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo，HERA cell 150i)、低速控溫離心機(jī)(Thermo Scientific CL10)、6孔板/24孔板/96孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿(NUNC)、高速控溫離心機(jī)(Thermo)、凍存管(NUNC)、6 cm/10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿(NUNC)、液氮罐(Thermofisher)、電動(dòng)移液器(Thermo Scientifi c FinnpipetteC1)、50 mL/15 mL 離心管(NUNC)、低粘附性培養(yǎng)皿、超凈臺(tái)、顯微鏡、水浴鍋。

2.實(shí)驗(yàn)方法 (1)制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的滋養(yǎng)層細(xì)胞 將懷孕13 d左右的昆明白鼠通過(guò)拉頸處死，無(wú)菌條件下，用彎鑷將子宮摘除，用PBS將血漬洗去。用剪刀將子宮和胎膜剪開(kāi)，把胚胎取出，然后把胚胎的頭部和內(nèi)臟剪除，經(jīng)過(guò)PBS充分洗滌，把組織剪成碎塊(體積在1 mm3以下)，經(jīng)過(guò)濾網(wǎng)，濾除大塊的組織塊，留取濾過(guò)液，然后放置在離心管中，大約安放5～10min，待分層后，把上清液去除，把含0.25%胰酶+0.04%EDTA溶液加到離心管中，約1mL，輕柔地吹吸，大約消化2min，之后終止消化(把等體積的MEF培養(yǎng)液加到離心管中)，隨后離心，800r，5min左右，留取沉淀。將細(xì)胞重懸于滋養(yǎng)層上，密度大約為5×105/mL,在5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%的融合度后進(jìn)行傳代，將細(xì)胞傳代三次后，將10μg/mL的絲裂霉素C加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸除，加入PBS，洗去殘存的死細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量的胰酶將細(xì)胞進(jìn)行消化，離心4min，轉(zhuǎn)速800，將離心后的細(xì)胞重新懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中，接種到經(jīng)過(guò)明膠處理的100mm培養(yǎng)皿中，密度約為5×104/mL。

(2)小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存在液氮中的小鼠胚胎干細(xì)胞取出，迅速解凍，放到離心管中進(jìn)行離心，速度800r，時(shí)間4min，把凍存液吸出，丟棄，加入2mL干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后把細(xì)胞接種于已經(jīng)處理好的細(xì)胞飼養(yǎng)層上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3d換1次細(xì)胞培養(yǎng)基。等到細(xì)胞長(zhǎng)至較密或者細(xì)胞團(tuán)塊過(guò)大后，加入胰酶進(jìn)行消化傳代，應(yīng)用差速貼壁法將MEF去除，然后接種到?jīng)]有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。干細(xì)胞培養(yǎng)液(1%的青鏈霉素、1 000 U/mL LIF、10%的干細(xì)胞胎牛血清、高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、0.1%的β-巰基乙醇)

(3)共培養(yǎng)及染色 把聚羥基脂肪酸脂膜剪成圓片狀，直徑約0.5cm，然后對(duì)其進(jìn)行消毒滅菌，首先放入75%乙醇中浸泡2h，緊接著，放到超凈臺(tái)中用紫外線照射約2h，隨后在保持膜表面平整的情況下，貼到96孔板中，加入培養(yǎng)基，浸泡過(guò)夜。然后將mESC接種到板中，保持細(xì)胞濃度1×104個(gè)/mL，與細(xì)胞補(bǔ)片共培養(yǎng)，每孔加入干細(xì)胞培養(yǎng)基200μL。在細(xì)胞培養(yǎng)3d后，固定細(xì)胞后制作電鏡標(biāo)本并進(jìn)行DAPI染色觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

(4)向心肌細(xì)胞分化 實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每組再細(xì)分為四個(gè)小組，八個(gè)孔為一個(gè)小組，編號(hào)為組一，二，三，四，組一用PHBHHx膜培養(yǎng)細(xì)胞，組二為傳統(tǒng)培養(yǎng)皿，組三鋪PHBHHx膜，組四為傳統(tǒng)培養(yǎng)皿，組一和組二加入含維生素C(0.1mg/L)的分化培養(yǎng)基[5](去除LIF),組三個(gè)組四用不添加任何誘導(dǎo)劑的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)孔細(xì)胞數(shù)大約2 000個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)基200nL，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞分化情況。

(5)心肌細(xì)胞的鑒定 加入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)15d后，觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈梭形，類似心肌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定心肌特異性標(biāo)志蛋白cTnT的表達(dá)情況。將培養(yǎng)基用吸管吸除，加入PBS清洗3遍以上，加入4%的多聚甲醛，常溫固定20min，吸除多聚甲醛后，再加入PBS清洗，不少于3次，每次不少于5min。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行打孔(加入0.1% tritonX-100)，約10min。將上清液吸棄后，加入PBS清洗如上所述，之后加入5%的BSA(牛血清蛋白)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間約30min，之后吸棄上清，PBS充分洗滌，加入一抗兔抗鼠心肌肌鈣蛋白T，4度過(guò)夜，PBS充分清洗后，加入山羊抗兔熒光二抗，避光，孵育45min后，PBS充分洗滌，加入DAPI染色劑，染色30min(避光)，PBS充分洗滌后，加入封片劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

圖1 MEF生長(zhǎng)情況 A：第一代MEF；B：第2代MEF；C：第3代MEF

圖2 mESC在PHBHHx膜上粘附生長(zhǎng)；圖3 PHBHHx膜培養(yǎng)細(xì)胞增殖明顯比傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿培養(yǎng)要快

(6)心肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白cTnT的表達(dá)量 小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化15天后，吸除培養(yǎng)基，PBS充分洗滌后加入胰酶消化細(xì)胞2min，加入培養(yǎng)基終止消化，離心后，吸除上清液，收集細(xì)胞，離心5min(1 700r/min)，扣干，加入細(xì)胞打孔劑(0.1% tritonX-100),10min后，加入PBS充分洗滌，離心后棄掉上清液，然后加入BSA封閉細(xì)胞30min，離心后，吸除上清液，加入一抗，4°過(guò)夜后，加入二抗，避光孵育后上機(jī)檢測(cè)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料間兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。多組間差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)的生長(zhǎng)情況 MEF呈貼壁生長(zhǎng)，有較大的異質(zhì)性，大小差別較大，胞質(zhì)可向外伸出偽足，形成多種形狀，如多邊形、梭形，啞鈴型及不規(guī)則的形狀，細(xì)胞核位于中間，形狀類卵圓形。第一代培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞含有較多的雜細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞不純，從而可能影響細(xì)胞的活力。通過(guò)細(xì)胞傳代，發(fā)現(xiàn)第3代細(xì)胞比較純，細(xì)胞活力較強(qiáng)，所以選擇其作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。如圖1。

2.mESC與PHBHHx膜共培養(yǎng)DAPI染色 mESC生長(zhǎng)迅速，一般培養(yǎng)三天就可以傳代，傳代之后細(xì)胞生長(zhǎng)的更加迅速。當(dāng)成團(tuán)的細(xì)胞長(zhǎng)大后，加入消化酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，然后到PHBHHx膜中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，將細(xì)胞固定后，加入DAPI染色劑進(jìn)行細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖2所示，mESC與PHBHHx膜粘附良好，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，形態(tài)正常。并通過(guò)CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的活力，觀察細(xì)胞在膜上的增值情況。如圖3所示。

3.掃描電鏡觀察mESC在PHBHHx膜上的生長(zhǎng)粘附狀態(tài) 在mESC接種到PHBHHx膜上培養(yǎng)3天后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成掃描電鏡標(biāo)本后上機(jī)檢測(cè)，如圖4所示。細(xì)胞粘附在PHBHHx膜上，生長(zhǎng)良好。

圖4 掃描電鏡圖片 A：PHBHHx膜形態(tài)(×1000)；B：mESC在PHBHHx膜上生長(zhǎng)(×1000)

4.免疫熒光染色 在mESC接種到PHBHHx膜上誘導(dǎo)分化15d后，對(duì)其進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白-肌鈣蛋白(cTnT)進(jìn)行免疫熒光染色，蛋白發(fā)出紅色熒光，位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色，見(jiàn)圖5。

圖5 免疫瑩光染色圖 A：不加任何誘導(dǎo)劑組與PHBHHx膜共培養(yǎng)cTnT的表達(dá)；B：加維生素C誘導(dǎo)劑組與PHBHHx膜共培養(yǎng)cTnT的表達(dá)

5.流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定cTnT的表達(dá) 在mESC與PHBHHx膜共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化15d后，對(duì)其進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物cTnT進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如圖6：加維生素C誘導(dǎo)劑組cTnT(47.5±1.5)%>未加任何誘導(dǎo)劑組(7.1±1)%(P<0.05)。對(duì)于mESCs向心肌細(xì)胞的分化，在添加維生素C誘導(dǎo)劑的情況下，PHBHHx膜細(xì)胞培養(yǎng)分化cTnT的表達(dá)量(60.3±1.8)%傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)(47.5±1.5)%(P<0.05)。

討 論

近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療心肌梗死后心力衰竭是非常新穎的方法，大量的實(shí)驗(yàn)證明其在心肌細(xì)胞治療領(lǐng)域的有效性[6]。胚胎干細(xì)胞因能夠分化為人體所有三胚層細(xì)胞，所以成為應(yīng)用非常廣泛的種子細(xì)胞[7]。研究者發(fā)現(xiàn)通過(guò)將胚胎干細(xì)胞注入小鼠梗死模型中可以改善小鼠的左心室收縮功能[6]。但是，由于缺少相應(yīng)的載體，所以在移植治療過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量的流失[8]，導(dǎo)致治療效果欠佳。所以尋找一種能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)的補(bǔ)片材料來(lái)為移植細(xì)胞提供良好的生存環(huán)境是我們迫切需要解決的問(wèn)題，能夠提高干細(xì)胞在移植區(qū)的存活并促進(jìn)移植細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。

聚羥基脂肪酸脂是組織工程學(xué)中常用的材料，近年來(lái)發(fā)展較為迅速[9]。作為醫(yī)用材料已經(jīng)應(yīng)用到臨床的各個(gè)方面。PHBHHx作為PHA家族中非常重要的一員，具有非常優(yōu)良的生物相容性。先前的研究發(fā)現(xiàn)PHBHHx可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[10]，并且可以和神經(jīng)干細(xì)胞良好的融合并能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[11]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，利用小鼠胚胎干細(xì)胞與PHBHHx材料制作的細(xì)胞補(bǔ)片共培養(yǎng)，研究PHBHHx材料在治療心肌梗死方面的潛力。我們發(fā)現(xiàn)，PHBHHx膜材料可以與mESC完美融合，mESC可以在PHBHHx膜上粘附生長(zhǎng)，且相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，PHBHHx膜培養(yǎng)更能促進(jìn)mESC的增殖，培養(yǎng)3天后，我們用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力，PHBHHx膜組0D值為(0.726±0.021)，顯著高于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)mESC的OD值(0.312±0.004)，如上圖3。之后我們加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，在不用添加任何誘導(dǎo)劑的情況下，mESCs向心肌細(xì)胞分化其肌鈣蛋白cTnT的表達(dá)量為(8.19±0.88)%，

圖6 流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定cTnT表達(dá) A:不加任何誘導(dǎo)劑也無(wú)PHBHHx膜組cTnT蛋白的表達(dá)(8.19%)；B：加維生素C誘導(dǎo)劑但無(wú)PHBHHx膜組蛋白cTnT的表達(dá)(49.41%)，圖示為誘導(dǎo)效率最高的一組；C：不加任何誘導(dǎo)劑與PHBHHx膜共培養(yǎng)心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnT的表達(dá)(12.87%)；D：加誘導(dǎo)劑維生素C與PHBHHx膜共培養(yǎng)心肌細(xì)胞cTnT蛋白的表達(dá)(53.40%)，圖示為誘導(dǎo)效率最高的一組

本研究發(fā)現(xiàn)PHBHHx膜與mESC有較好的組織相容性，并且能夠促進(jìn)mESC的增殖和分化,但是需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)片材料能否改善心肌梗死后的心臟收縮功能。