養(yǎng)血解毒湯對(duì)銀屑病模型小鼠JAKs-STAT信號(hào)通路及炎性因子的影響

肖衛(wèi)棉 查旭山

(肇慶市皮膚病醫(yī)院皮膚科，廣東 肇慶 526020)

銀屑病是慢性炎癥增生性疾病，是皮膚科多發(fā)病、常見(jiàn)病，容易反復(fù)發(fā)作，是皮膚科難治病之一，屬于自身免疫性疾病，以紅斑鱗屑為主要臨床表現(xiàn)，主要特點(diǎn)為角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化和過(guò)度增殖〔1,2〕。養(yǎng)血解毒湯在銀屑病的治療上效果顯著〔3〕，但其機(jī)制尚不十分清楚。本文選擇昆明小鼠雌激素期增生的陰道上皮模型和尾鱗片表皮模型，觀察養(yǎng)血解毒湯對(duì)銀屑病的干預(yù)作用及對(duì)Janus激酶(JAKs)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號(hào)通路及炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性、體重20～24 g、昆明種小鼠24只，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0004。

藥物：養(yǎng)血解毒湯所含藥物土茯苓、當(dāng)歸、雞血藤、玄參、草河車(chē)、麥冬、生地、車(chē)前子、板藍(lán)根、丹參等由該院中藥房提供，制劑室按成人劑量換算成小鼠用量，制成水煎劑，質(zhì)量控制由制劑室負(fù)責(zé)。甲氨蝶呤片(廠家：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32024655，批準(zhǔn)日期：2015-09-02，規(guī)格2.5 mg)，戊酸雌二醇片(廠家：北京協(xié)和藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000031，批準(zhǔn)日期：2010-12-17，規(guī)格：0.5 mg)。

主要試劑：二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(美國(guó)Abcam公司)，兔抗人STAT3單克隆抗體、兔抗人磷酸化(P)-STAT3單克隆抗體、兔抗人STAT5單克隆抗體、兔抗人P-STAT5單克隆抗體，TRIzol總RNA提取試劑(美國(guó)Sigma公司)等。

1.2方法

1.2.1模型建立 雌激素周期小鼠陰道上皮模型：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3 d給予昆明小鼠戊酸雌二醇(每天1次，每次10 mg/ml)灌胃，使陰道上皮處于雌激素期從而模擬昆明小鼠表皮增生過(guò)快特點(diǎn)。尾部鱗片表皮模型：昆明小鼠尾部鱗片表皮正常角化，沒(méi)有顆粒層形成，可直接模擬銀屑病角化不全、分化障礙的特點(diǎn)。

1.2.2小鼠分組及處理 將24只昆明小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為生理鹽水組、養(yǎng)血解毒湯組、甲氨蝶呤組，每組8只。養(yǎng)血解毒湯組小鼠每天給予養(yǎng)血解毒湯水煎劑(0.2 ml)灌胃，甲氨蝶呤組小鼠每天給予甲氨蝶呤片水溶液(0.2 ml)灌胃，生理鹽水組每天給予等量生理鹽水灌胃，共6 d。

1.2.3各組小鼠陰道上皮有絲分裂指數(shù)測(cè)定 治療結(jié)束次日清晨9點(diǎn)脫臼處死小鼠，取陰道組織用甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察小鼠陰道上皮有絲分裂的基底細(xì)胞，計(jì)算陰道上皮有絲分裂指數(shù)，陰道上皮有絲分裂指數(shù)為每100個(gè)基底細(xì)胞中有絲分裂細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.4各組小鼠尾部顆粒層片數(shù)測(cè)定 取小鼠尾部皮膚用甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察小鼠的尾部鱗片數(shù)，有顆粒層形成的鱗片為鱗片表皮有連續(xù)成行的顆粒細(xì)胞，尾部顆粒層片數(shù)為每100個(gè)鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)。

1.2.5小鼠陰道上皮和尾部組織中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表達(dá)測(cè)定 將小鼠陰道上皮和尾部組織切片脫蠟至水，采用免疫組化法測(cè)定組織中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表達(dá)，將各組小鼠的免疫組化圖像經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析得出陰道上皮和尾部組織中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5的光密度值。

1.2.6小鼠陰道上皮和尾部組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、干擾素(INF)-γ mRNA測(cè)定 將各組小鼠陰道上皮組織和尾部組織研磨后，提取總RNA，測(cè)定RNA的含量和純度，選取RNA完整、無(wú)污染的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR測(cè)定陰道上皮和尾部組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA表達(dá)，PCR擴(kuò)增條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s、55℃ 5 s共39個(gè)循環(huán)；65℃ 5 s、95℃ 10 s。以2-ΔΔCt作為T(mén)NF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組陰道上皮有絲分裂指數(shù)比較 三組小鼠陰道上皮有絲分裂指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.001，P=0.000)，其中養(yǎng)血解毒湯組(13.29±2.21)和甲氨蝶呤組(12.58±1.87)小鼠陰道上皮有絲分裂指數(shù)均低于生理鹽水組(30.03±4.59，P<0.05)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠陰道上皮有絲分裂指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組小鼠尾部顆粒層片數(shù)比較 三組小鼠尾部顆粒層片數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.082，P=0.000)，其中養(yǎng)血解毒湯組(12.28±1.11)和甲氨蝶呤組(13.19±1.23)小鼠尾部顆粒層片數(shù)高于生理鹽水組(7.76±1.02，P<0.05)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠尾部顆粒層片數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表達(dá)比較 三組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中STAT3和STAT5光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，P-STAT3和P-STAT5光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組P-STAT3、P-STAT5光密度值低于生理鹽水組(P<0.05)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組P-STAT3、P-STAT5光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5顆粒光密度值比較

與生理鹽水組比較:1)P<0.05；下表同

2.4各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA比較 三組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA低于生理鹽水組(P<0.05)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組陰道上皮中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA水平比較

3 討 論

銀屑病與多基因遺傳關(guān)系密切，病灶內(nèi)異常T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為銀屑病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，異常活化的T細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，細(xì)胞因子通過(guò)JAKs/STATs等多條信號(hào)通路，參與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化、過(guò)度角化、血管異常增生等多種病理過(guò)程，因此JAKs/STATs信號(hào)通路在銀屑病的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)及細(xì)胞信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用〔4，5〕。

STAT是JAKs的作用底物，是一種獨(dú)特的蛋白家族，能夠與DNA結(jié)合。STAT包含7個(gè)家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6，STATs在未激活細(xì)胞中存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)促紅細(xì)胞生成素、集落刺激因子、干擾素等因子和受體結(jié)合后，引起受體二聚化，相應(yīng)受體的二聚化使JAKs發(fā)生磷酸化而被活化，磷酸化的JAKs使相連受體的酪氨酸殘基磷酸化，酪氨酸殘基的磷酸化使酪氨酸位點(diǎn)暴露，并與氨基酸序列結(jié)合，把含有SH2結(jié)構(gòu)域的STATs吸引到酪氨酸位點(diǎn)處，JAKs引起與受體相連的STATs磷酸化，磷酸化的STATs從受體脫落，形成二聚體，活化的STATs二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，和目標(biāo)啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)〔6，7〕。

銀屑病為一種T細(xì)胞異常表達(dá)的免疫性疾病，在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中，T細(xì)胞局部活化發(fā)揮重要作用〔8，9〕，活化的T細(xì)胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ等一系列細(xì)胞因子，分泌的上述細(xì)胞因子刺激鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等通過(guò)旁分泌或者自分泌的方式分泌大量細(xì)胞因子，使多種細(xì)胞因子發(fā)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)；各細(xì)胞因子之間相互調(diào)節(jié)，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)〔10，11〕。

養(yǎng)血解毒湯的君藥為雞血藤和土茯苓，雞血藤具有養(yǎng)血作用，土茯苓具有解毒作用，佐以當(dāng)歸、丹參、草河車(chē)、板藍(lán)根、玄參，當(dāng)歸和丹參具有養(yǎng)血潤(rùn)膚作用，草河車(chē)、板藍(lán)根、玄參具有祛濕解毒作用，體現(xiàn)了養(yǎng)血解毒湯的養(yǎng)血活血、祛濕解毒的治療原則〔12〕，在銀屑病的治療中效果顯著〔13〕。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血解毒湯可降低小鼠陰道上皮有絲分裂指數(shù)，升高尾部顆粒層片數(shù)，降低小鼠陰道上皮和尾部皮膚中P-STAT3、P-STAT5表達(dá)及陰道上皮和尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA表達(dá)，其作用效果與甲氨蝶呤類(lèi)似?？梢?jiàn)，養(yǎng)血解毒湯對(duì)銀屑病具有治療作用，其機(jī)制可能與養(yǎng)血解毒湯可抑制上皮細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)表皮顆粒層生成、抑制STAT3和STAT5磷酸化，減少炎性因子水平有關(guān)。銀屑病患者體內(nèi)存在免疫平衡失調(diào)，TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ等炎性細(xì)胞因子分泌異常，炎性因子的異常分泌作為細(xì)胞外刺激信號(hào)激活角質(zhì)形成細(xì)胞上的JAKs激酶，引起JAKs發(fā)生自身磷酸化，募集細(xì)胞內(nèi)的STATs形成二聚體，STATs二聚體進(jìn)入細(xì)胞核與相關(guān)基因結(jié)合，對(duì)T細(xì)胞分化、毛細(xì)血管增生、角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖等過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用，從而引起銀屑病的發(fā)生發(fā)展〔14，15〕。