利用SCID小鼠建立子宮內(nèi)膜異位癥模型的方法探討

羅碧云, 李 莉, 江 玲

(1. 深圳市龍華區(qū)婦幼保健院, 深圳 518109;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 廣州 510405)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)是指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及宮體肌層以外的其他部位。EMT病變廣泛、形態(tài)多樣、極具侵襲性和復(fù)發(fā)性, 具有性激素依賴的特點(diǎn)[1]。然而其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確, 因此, EMT動(dòng)物模型的建立對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究、治療方案的改善等探索的意義重大。1984年，Jones等[2]成功用自體移植法建立SD大鼠內(nèi)異癥模型。有研究[3]表明對(duì)比手術(shù)逆流法與種植法的成模率，逆流組70%，種植組90%。若作為人子宮內(nèi)膜組織物移植受體動(dòng)物，需排除自身免疫排斥反應(yīng)，盡可能大地還原基礎(chǔ)模型并保證存活率，而大鼠模型無(wú)法達(dá)到這一要求。SCID小鼠是基因突變的CB-17近交系小鼠，為先天性T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物[4], 可以克服異種間的免疫排斥反應(yīng), 移植后的組織可保持原有的組織形態(tài)及生化特性, 且移植后的組織存活率較裸小鼠高, 易于發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移, 故國(guó)外已將SCID小鼠作為人子宮內(nèi)膜組織的常用受體動(dòng)物。Rossi等[5]用腹腔注射法成功建立了BALB/c小鼠的EMT模型。本實(shí)驗(yàn)基于SCID小鼠EMT模型觀察周期短，可極大程度保持原有移植物組織形態(tài)及生化表現(xiàn)，擬探究腹腔注射法建立SCID小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的擬合程度及可操作性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)56～62日齡雌性SCID小鼠18只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]，體質(zhì)量為17～25 g，飼養(yǎng)于 SPF設(shè)施[SYXK(粵)2013-0092], 24 ℃恒溫, 12 h光照 12 h黑暗交替，自由攝取食物和水。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材及試劑

無(wú)菌操作臺(tái)、無(wú)菌手術(shù)器械、無(wú)菌PBS液, 購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司; 含人子宮內(nèi)膜碎片的PBS液, 獸用苯甲酸雌二醇注射液, 購(gòu)自南昌前景獸藥有限公司; 無(wú)菌DMEM培養(yǎng)液(含100U/mL青霉素, 100 U/mL鏈霉素), 購(gòu)自廣州瑞舒生物科技公司。

1.3 模型制備

充分知情同意下，取在申報(bào)單位附屬醫(yī)院腹腔鏡下確診為I～I(xiàn)I期EMT患者的病理確診為分泌期子宮內(nèi)膜，將新鮮的標(biāo)本置入含無(wú)菌DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中, 并用0.1 mol/L無(wú)菌PBS液漂洗3次，以洗去血塊和粘液，用無(wú)菌眼科剪刀將內(nèi)膜標(biāo)本剪成0.5～1 mm3的內(nèi)膜碎片, 平均分裝至1 mL PBS溶液的針管內(nèi)，備用。內(nèi)膜種植在取材后半小時(shí)內(nèi)完成。將小鼠固定在無(wú)菌操作臺(tái)上，腹部酒精常規(guī)消毒后用16號(hào)針頭于小鼠下腹正中行腹腔穿刺，注入含子宮內(nèi)膜碎片的PBS液0.2 mL, 含內(nèi)膜碎片8～10塊, 壓迫穿刺點(diǎn), 觀察無(wú)出血。種植第2日小鼠腿部肌注給予30 mg/kg體質(zhì)量的苯甲酸雌二醇，以利于子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)種植。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

常規(guī)飼養(yǎng)4周后，肉眼觀察見(jiàn)小鼠精神狀態(tài)變差，或體質(zhì)量下降、或?yàn)橄輵B(tài)或生長(zhǎng)緩慢，毛發(fā)稀疏(圖1)，反應(yīng)較遲鈍，活動(dòng)減少，但食欲良好，大便小便正常。開(kāi)腹探查后，肉眼觀察均可見(jiàn)不典型內(nèi)異癥病灶生成，或?yàn)榛液稚珒?nèi)異癥結(jié)節(jié)，或形成內(nèi)異囊腫(圖2)。

2.2 病理學(xué)觀察

本次實(shí)驗(yàn)造模數(shù)為18只，成活率100%。取病灶行病理檢測(cè)，均未見(jiàn)典型的子宮內(nèi)膜腺體，部分可見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出和(或)紅細(xì)胞或含鐵血黃素沉積(圖3A、B)。部分僅見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出，未形成炎性囊腫或膿腫可能(圖3C、D)。

3 討論

圖1 模型小鼠外觀觀察

圖2 模型小鼠剖檢觀察

圖3 造模小鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)觀察

典型的子宮內(nèi)膜異位病灶病理具備“三要素”[6]： ①囊壁內(nèi)襯上形態(tài)類似子宮內(nèi)膜腺上皮;②上皮下有子宮內(nèi)膜樣間質(zhì); ③伴有新鮮或陳舊性出血，可見(jiàn)紅細(xì)胞、含鐵血黃素沉積或吞噬含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞。非典型的組織形態(tài)表現(xiàn)為“三要素”有缺項(xiàng)： 內(nèi)襯上皮脫落，或僅見(jiàn)少數(shù)不完整的可疑內(nèi)膜間質(zhì); 出血等繼發(fā)改變現(xiàn)象不明顯或只能見(jiàn)到含鐵血黃素物質(zhì)沉積，但缺乏特異性。

EMT的發(fā)病機(jī)制尚未明確, 其動(dòng)物模型的建立在科研方面意義深遠(yuǎn)[7]。Bergqvist等[8]將EMT患者在位及異位內(nèi)膜組織同時(shí)種植到同只裸小鼠(n=24)腹部皮下, 成模率為34.4%。Fortin等[9]將人子宮內(nèi)膜與編碼綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒孵育后種植到小鼠皮下, 其腺病毒僅可轉(zhuǎn)染15%～ 40%的內(nèi)膜細(xì)胞。Novella-Maestre等[10]、Banu等[11]均采用腹腔注射法將子宮內(nèi)膜細(xì)胞注射到裸小鼠腹腔(n=7、n=16)，EMT成模率100%。但因其造模數(shù)少，僅可供參考, 無(wú)法以此衡量造模之優(yōu)劣。單婧等[12]認(rèn)為小鼠模型因其體型小、操作性低、死亡率高等，導(dǎo)致成模率低。崔陽(yáng)陽(yáng)等[13]認(rèn)為免疫缺陷小鼠模型雖不存在排斥反應(yīng)，但在不同程度上影響了腹腔液中的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子。Weed等[14]也提出EMT和機(jī)體免疫相關(guān)，至今已有不少證據(jù)支持免疫[15]及炎癥因素[16]在EMT發(fā)病機(jī)制中的重要作用。有學(xué)者[17]認(rèn)為利用人子宮內(nèi)膜進(jìn)行移植存在倫理問(wèn)題且免疫缺陷小鼠免疫功能的缺乏限制了EMT免疫機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射法建立SCID小鼠EMT模型結(jié)果不理想，因其易形成炎性囊腫，影響盆腔微環(huán)境，且異體移植組織較小，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，手術(shù)操作困難。

綜上所述，采用腹腔注射法建立SCID小鼠EMT模型，其擬合程度、可操作性較低，不宜作為EMT動(dòng)物模型的首選。