豬戊型肝炎病毒血清抗體間接ELISA檢測方法的建立與應用

丁 軍，趙曉靜，虞楷銳，周天明，李慧霞，盛亞敏，陳宜陽，劉寶元，孫亞妮，周恩民，趙 欽

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院，農業(yè)部獸用藥物與診斷技術陜西科學觀測實驗站，楊凌 712100)

戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)感染所致的一種人獸共患病，豬和野鹿可能是HEV的自然儲存宿主[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織2017年7月公布的數(shù)據(jù)，全球每年約有2 000萬人感染HEV，其中約330萬人出現(xiàn)戊肝癥狀，戊型肝炎在2015年造成的死亡約有4.4萬例[2]。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，我國多數(shù)省份有HE的暴發(fā)，且處于不斷上升的趨勢[3-4]，戊型肝炎感染已逐漸成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。

豬HEV是第一個動物HEV分離株，隨著越來越多豬HEV分離株的鑒定，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)豬群中主要存在基因3和4型HEV[5-6]，而我國豬群中流行的HEV主要以基因4型為主[7]。HEV感染豬的臨床癥狀比較溫和，僅引起亞臨床感染，但是，由于其人畜共感染的特性，必須做好豬群中HEV感染的監(jiān)控。目前，豬HEV感染的診斷方法主要是病毒核酸的RT-PCR和血清中豬HEV抗體的ELISA檢測。但是RT-PCR技術操作復雜、成本高，容易污染，而ELISA以其簡易和高通量的優(yōu)點被廣泛使用[8-10]。此外，目前并沒有任何商品化的豬HEV疫苗，因此，利用ELISA檢測豬HEV抗體可以監(jiān)測豬群中豬HEV感染情況。但是，目前市面上幾種商品化的豬HEV ELISA試劑盒，一類使用檢測人血清中HEV抗體的商品化ELISA試劑盒檢測豬血清中豬HEV抗體，導致檢測結果難以判定；還有一類分別采用豬HEV衣殼蛋白不同的抗原肽作為包被抗原，導致不同商品化試劑盒的檢測結果符合率較低[11]。因此，急需建立一種準確性、敏感性和特異性較高的ELISA方法，為豬群中HEV感染的監(jiān)控提供技術支撐。

本研究以原核表達并純化的不含有任何標簽的豬HEV衣殼蛋白C端268個氨基酸為包被抗原，通過優(yōu)化ELISA條件，并評價其應用性，建立了敏感性和特異性較高的豬HEV抗體間接ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株和血清

基因4型豬源HEV CHN-SD-sHEV株分離自山東某屠宰場，GenBank登錄號為KF176351。豬HEV陽性血清由本實驗室通過CHN-SD-sHEV株感染HEV陰性豬制備；91份陰性血清采自HEV RNA和抗體均為陰性的豬；豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬流感病毒和豬細小病毒的陽性血清均由本實驗室從臨床樣品獲得；45份豬HEV感染豬后連續(xù)不同周齡血清也由本實驗室通過CHN-SD-sHEV感染陰性豬制備；477份臨床豬血清采自陜西省不同地區(qū)的商品化豬場。

1.2 主要試劑

分子生物學相關試劑購自北京全式金生物技術有限公司；HRP標記的羊抗豬IgG抗體購自Sigma公司；TMB顯色液購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；三種豬HEV抗體檢測商品化試劑盒分別購自北京萬泰生物藥業(yè)、南京森貝伽和上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 包被抗原的制備

1.3.1 豬HEV衣殼蛋白C端268個氨基酸在大腸桿菌中的原核表達 利用RT-PCR方法擴增編碼豬HEV衣殼蛋白C端268個氨基酸區(qū)域的核酸序列，然后利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切、T4連接酶連接至原核表達載體pET-21b(+)，構建重組表達質粒pET-21b-sHEV-ORF2-C。將重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達，蛋白命名sHEV-ORF2-C。SDS-PAGE分析蛋白是否表達。

1.3.2 表達蛋白的復性和純化 將超聲裂解后8 mol·L-1尿素溶解的目的蛋白置于透析袋中，將透析袋放入裝有20倍以上蛋白樣品體積的復性液PBS(pH 7.4)溶液的燒杯中，在4 ℃下，用磁力攪拌器中速地攪拌復性液，以加速溶液的滲透和擴散。每隔2～3 h換1次等量新鮮的復性液，重復4次。收集復性后的樣品，經4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min， 上清即為目的蛋白的復性液。

利用AKTA Pure 25蛋白自動純化系統(tǒng)和Superdex 200 increase凝膠過濾柱對復性獲得的蛋白進行純化，SDS-PAGE分析蛋白純化效果。

1.3.3 表達蛋白抗原性分析 將重組載體、空載體的大腸桿菌表達產物，以及純化的蛋白同時進行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白質濕轉，轉移至PVDF膜上，利用豬HEV陽性血清為一抗，Western blot分析表達純化的sHEV-ORF2-C蛋白的反應原性。

1.4 間接ELISA檢測方法的建立

1.4.1 間接ELISA方法操作步驟 將復性、純化的蛋白sHEV-ORF2-C用包被緩沖液稀釋后，包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃過夜。棄去包被液，PBST洗滌3次，加入封閉液，每孔200 μL，室溫封閉1 h。PBST洗滌后，分別加入含有10%大腸桿菌裂解液的封閉液稀釋的待檢血清以及豬HEV陽性和陰性血清，每孔100 μL，室溫孵育1 h。PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG，每孔100 μL，室溫孵育1 h。PBST洗滌后加入TMB顯色液，室溫顯色15 min，最后加入3 mol·L-1H2SO4終止液終止反應，酶標儀測定OD450 nm值。

1.4.2 最佳ELISA工作條件的確定 采用方陣滴定法確定包被抗原的最佳包被濃度，以及陰性、陽性豬血清的最佳稀釋比例，從而確定待檢血清的最佳稀釋比例。通過優(yōu)化包被緩沖液、最佳封閉液以及最佳二抗工作濃度，最終確定ELISA的最優(yōu)工作條件。

1.4.3 臨界值的確定 取91份豬HEV陰性血清，在已確定的優(yōu)化條件下進行ELISA檢測，經統(tǒng)計學分析，得到所有陰性血清的OD450 nm的平均值和標準差。根據(jù)統(tǒng)計學原則，ELISA的陰、陽性判定值(Cut-off)=所有陽性血清OD450 nm平均值+3×標準差。待檢血清OD450 nm值≥ Cut-off值判定為陽性，OD450 nm< Cut-off值判定為陰性。

1.5 特異性試驗

分別將豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬流感病毒和豬細小病毒的陽性血清按照已建立的ELISA方法進行檢測，同時設立豬HEV陰性和陽性血清對照，分析其他重要豬疫病陽性血清是否與包被的抗原發(fā)生反應。

1.6 敏感性試驗

將豬HEV陽性血清按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400和1∶12 800稀釋后，用該ELISA檢測，根據(jù)Cut-off值分析該ELISA的敏感性。

1.7 重復性試驗

板內重復性試驗：利用純化的蛋白包被ELISA板，分別隨機選取4份豬HEV陽性和陰性血清，每份樣品設立3個重復孔，按優(yōu)化條件進行ELISA操作，計算同一份樣品OD450 nm值的變異系數(shù)(CV%)，以檢驗板內檢測樣品的重復性。

板間重復性試驗：取三塊酶標板，以同一批制備的蛋白包被，同樣利用上述選取的4份豬HEV陽性和陰性血清，按優(yōu)化條件進行ELISA檢測，計算板間相同樣品OD450 nm值的變異系數(shù)(CV%)，以檢驗板間檢測樣品的重復性。

1.8 對比試驗

利用建立的ELISA方法與萬泰HEV抗體檢測試劑盒、南京森貝咖和上海酶聯(lián)豬HEV抗體檢測試劑盒同時對臨床收集的182份豬血清進行檢測，對比試驗結果，分析本研究建立的ELISA方法與上述三種商品化試劑盒的符合率。

1.9 臨床應用

運用建立的ELISA方法，對實驗室保存的豬HEV感染不同周(0～8周)的45份血清和陜西楊凌區(qū)周邊不同集約化養(yǎng)豬場的477份豬血清進行檢測。

2 結 果

2.1 SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表達和純化

將重組表達質粒pET-21b-sHEV-ORF2-C和空載體pET-21b轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析sHEV-ORF2-C蛋白獲得表達，大小約為40 ku(圖1A)。超聲波裂解菌液，蛋白主要以包涵體的形式存在。通過蛋白復性以及分子篩純化后，獲得比較純的目的蛋白。利用豬HEV陽性豬血清分析表達蛋白的抗原性，Western blot結果證明表達的蛋白反應原性較好(圖1B)。

M.預染蛋白質相對分子質量標準；1. pET-21b(+)空載體誘導表達；2. 重組質粒pET-21b-sHEV-ORF2-C誘導表達；3. 分子篩純化的目的蛋白；4. 未純化目的蛋白與陽性豬血清免疫印跡；5. 純化目的蛋白與陽性豬血清免疫印跡M. Prestained protein marker; 1.pET-21b(+) blank vector; 2. Recombinant plasmid pET-21b-sHEV-ORF2-C; 3. Purified protein; 4. Unpurified protein reacting with the positive pig sera; 5. Purified protein reacting with the positive pig sera圖1 SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鑒定目的蛋白的表達Fig.1 Identification of the target protein by SDS-PAGE (A) and Western blot (B)

2.2 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定

棋盤滴定法檢測結果顯示，當酶標板每孔包被抗原200 ng，血清稀釋度為1∶200時，陽性血清OD450 nm值為2.865，陰性血清相應值為0.059，陽性和陰性血清OD450 nm值相差最大(P/N=48.56)。因此，200 ng為最佳的抗原包被量，1∶200為最佳血清稀釋度(表1)。

2.3 最佳包被緩沖液和封閉液的確定

將純化的抗原分別用0.01 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)和0.01 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)包被酶標板，4 ℃過夜。然后再分別用2.5% 脫脂奶粉和5%脫脂奶粉作為封閉液，室溫孵育1 h，其他步驟按照優(yōu)化的ELISA條件檢測陽性和陰性血清。結果顯示當用0.01 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液包被，2.5%脫脂奶粉封閉時，陽性血清的OD450 nm值可達2.145，陰性血清相應值為0.054，且此時陽性和陰性血清的OD450 nm值相差最大(P/N=39.85)，因此選擇0.01 mol·L-1碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，2.5%的脫脂奶粉為封閉液(表2)。

表1間接ELISA最佳抗原包被量和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定(OD450 nm)

Table1Determinationofoptimalamountofcoatingantigenanddilutionofsera(OD450 nm)

血清稀釋倍數(shù)Serum dilution包被抗原量/(ng·孔-1)Antigen amount501002004001∶50+1.4681.5681.6321.712-0.0980.0980.0950.098P/N15.0616.0017.1817.381∶100+1.5031.7151.9221.889-0.0790.0670.0670.068P/N19.0325.6028.6927.931∶200+1.8302.0752.8652.124-0.0580.0540.0590.052P/N31.5538.4348.5640.801∶400+1.5411.6981.8131.676-0.0460.0430.0420.043P/N33.1439.4942.6638.98

P/N值系用未修約實測值計算，下表同

P/Nvalue were calculated using the data before rounding off. The same as below

表2最佳包被緩沖液和封閉液的確定(OD450 nm)

Table2Determinationofoptimalcoatingandblockingbuffers(OD450 nm)

包被液Coating buffer封閉液Blocking buffer2.5%脫脂奶粉2.5% dry milk5%脫脂奶粉5% dry milk碳酸鹽緩沖液+2.1451.867Carbonate buffer-0.0540.057P/N39.8532.75磷酸鹽緩沖液+1.5431.378PBS buffer-0.0670.067P/N23.0020.56

2.4 酶標二抗最佳工作濃度的確定

將商品化HRP標記的羊抗豬二抗，按照說明書分別選取1∶5 000和1∶10 000稀釋，利用ELISA檢測陽性和陰性豬血清，結果(表3)顯示當二抗稀釋比例為1∶5 000時，陽性和陰性血清OD450 nm值相差最大(P/N=55.87)。因此，HRP標記的羊抗豬二抗最佳稀釋比例為1∶5 000。

表3酶標二抗最佳稀釋比例的確定(OD450 nm)

Table3Determinationofoptimaldilutionofsecondantibody(OD450 nm)

二抗稀釋倍數(shù)Second antibodies dilution陽性Positive陰性NegativeP/N1∶5 0002.9050.05255.871∶10 0002.1190.04745.09

2.5 臨界值的確定

對91份豬HEV陰性豬血清進行ELISA檢測，OD450 nm值的平均值為0.104，標準差為0.064。根據(jù)公式算得Cut-off值為0.296，即待檢血清OD450 nm值≥0.296時判定為陽性，OD450 nm值<0.296時則判定為陰性。

2.6 特異性試驗

用建立的ELISA方法對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬流感病毒和豬細小病毒的陽性血清以及豬HEV的陰性和陽性血清進行檢測，其OD450 nm值分別為0.063、0.076、 0.059、0.092、0.067、0.051和2.204。其他病毒的陽性血清和豬HEV陰性血清的OD450 nm值均< 0.296，表明建立的ELISA特異性好。

2.7 敏感性試驗

將豬HEV陽性血清分別進行1∶100～1∶12 800 倍比稀釋，然后用建立的ELISA進行檢測，結果顯示，當陽性血清1∶6 400稀釋時，其OD450 nm值仍大于0.296，而1∶12 800稀釋時，OD450 nm值小于0.296(表4)。

表4間接ELISA敏感性試驗結果(OD450 nm)

Table4SensitivityofthedevelopedindirectELISA(OD450 nm)

血清稀釋倍數(shù)Serum dilution陽性血清Positive serum陰性血清Negative serum1∶1002.0810.208 71∶2002.2010.163 41∶4002.0120.121 21∶8001.8360.094 31∶1 6001.2450.079 81∶3 2000.6840.045 61∶6 4000.3470.042 31∶12 8000.0920.032 1

2.8 重復性試驗

板內重復試驗是將8份不同豬血清(4份陽性和4份陰性血清)，在同一塊酶標板上各重復檢測3次，計算標準差。結果板內重復試驗變異系數(shù)最大為7.05%，最小為0.09%，表明同一樣品在同一板內檢測變異系數(shù)很小，重復性好(表5)。

板間重復試驗是將8份不同的豬血清同時在3塊酶標板上檢測，每塊板重復檢測3次，計算標準差。結果顯示每份血清在不同板之間OD450 nm值相差甚微，板間變異系數(shù)最大為7.68%，最小為1.22%，表明同一份樣品在不同酶標板之間變異系數(shù)也很小，重復性好(表5)。

2.9 與商品化試劑盒符合率試驗

用本研究建立的ELISA方法和北京萬泰、南京森貝咖和上海酶聯(lián)三種商品化豬HEV抗體檢測試劑盒同時檢測182份臨床豬血清，結果表明建立的ELISA檢測陽性93份，陰性89份；北京萬泰商品化試劑盒檢測陽性77份，陰性105份；上海酶聯(lián)商品化試劑盒檢測陽性47份，陰性135份；南京森貝咖商品化試劑盒檢測陽性僅11份，陰性171份。該ELISA方法與三種商品化試劑盒的符合率分別為91.2%、53.3%和51.6%(表6)。

表5間接ELISA板內和板間重復試驗結果

Table5ReproducibilityanalysisofthedevelopedindirectELISA

豬血清編號Serum No.板內變異試驗Inter-assay variability板間變異試驗Intra-assay variability平均值x-標準差s變異系數(shù)/%CV平均值x-標準差s變異系數(shù)/%CV12.3280.0381.622.3370.0964.1222.1710.0793.562.1600.0743.4232.1120.0914.292.0850.0572.7342.3130.0552.402.2710.0662.9050.0570.0047.050.0590.0032.7860.0710.0023.240.0730.0011.9070.0640.0010.090.0650.0057.6880.0690.0072.340.0690.0011.22

表6間接ELISA與三種商品化試劑盒對比試驗結果

Table6ComparisonsofthedevelopedindirectELISAwiththethreecommercialkitsfordetectinganti-swineHEVantibodiesinpigsera

檢測方法Detection methods陽性Positive陽性符合率/%Positive coincidence陰性Negative陰性符合率/%Negative coincidence總符合率/%Total coincidenceELISA9389北京萬泰試劑盒7782.810510091.2上海酶聯(lián)試劑盒4729.013578.753.3南京森貝咖試劑盒118.617196.651.6

2.10 臨床樣品檢測

應用建立的ELISA檢測豬HEV感染5頭HEV陰性豬后不同周的血清，結果顯示，感染后第2周，所有豬開始HEV抗體轉陽，其中2頭感染后第7周抗體轉陰，而其余3頭豬感染后第8周，ELISA檢測結果仍呈陽性(圖2)。應用建立的ELISA檢測楊凌周邊10個集約化豬場共477份血清，檢測結果顯示8個豬場為豬HEV抗體陽性，477份血清中210份為陽性，陽性率為44.03%。不同豬場的檢測結果見表7。

3 討 論

戊型肝炎是人畜共患疾病，近幾年發(fā)病率逐年升高，嚴重危害人類健康。豬、野鹿和兔是HEV的自然儲存宿主[1]。1997年Meng等[5]首次從豬體內分離獲得豬HEV，并發(fā)現(xiàn)豬HEV可以感染人。因此，密切監(jiān)控豬群中HEV感染具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，對豬HEV的檢測技術主要包括免疫電鏡、巢式RT-PCR和ELISA[12]。其中，ELISA檢測快速且方便，被廣泛應用[10]，但是目前豬HEV抗體檢測的ELISA方法，一類是利用人HEV抗體檢測的商品化試劑盒通過二抗(由抗人變?yōu)榭关i)的改變進行檢測，ELISA條件需要重新優(yōu)化，導致結果難以判定；還有一類商品化試劑盒分別采用豬HEV ORF2和ORF3蛋白的不同抗原肽為包被抗原，由于不同抗原肽引發(fā)豬免疫應答反應的差異性，導致該類試劑盒檢測結果的符合率差。因此，急需建立一種準確性、敏感性和特異性較高的ELISA方法。本研究利用原核表達的豬HEV ORF2蛋白C端268個氨基酸區(qū)域為包被抗原，通過優(yōu)化ELISA條件，并分析方法的敏感性和特異性，成功建立了豬HEV抗體檢測的間接ELISA方法。同時，利用該方法檢測豬HEV感染后不同時間以及臨床收集的豬血清，結果表明該ELISA方法可以用于豬群中HEV感染的監(jiān)測。

圖2 間接ELISA檢測豬HEV攻毒后豬血清中抗體變化規(guī)律Fig.2 Detection of anti-swine HEV IgG antibodies in sera from the challenged pigs by the indirect ELISA

表7間接ELISA檢測臨床豬血清中豬HEV抗體結果

Table7Detectionofanti-swineHEVIgGantibodiesintheclinicalpigserafromdifferentflocksbytheindirectELISA

豬場Pig farm樣品總數(shù)Total number陽性樣品數(shù)Positive number陽性率/%Positive rate畢公482450.00本原483777.08實訓483266.67金鳳483062.50李家481531.25延川4800鳳翔484593.75黃陵45511.11五泉4800姚安482245.83

不同哺乳動物HEV分離株主要分為8個基因型[13]，基因3和4型可感染豬，我國豬群中主要流行基因4型[6-7]。不同HEV基因型僅有一個血清型，因此，不同基因型的ORF2蛋白均可以用于檢測豬血清中的HEV抗體，但也有研究表明不同基因型的ORF2蛋白檢測的結果會有部分差異[11]。我們建立的ELISA方法與北京萬泰商品化試劑盒符合率為91.2%，而北京萬泰試劑盒是采用基因1型HEV ORF2蛋白為包被抗原，因此，部分不符合的樣品可能是由于不同基因型抗原差異所導致，進一步證實了上述推論。因此，本研究利用我國豬群中流行的基因4型豬HEV ORF2蛋白為包被抗原，進一步提高了豬HEV抗體檢測的特異性和敏感性。

豬HEV全長ORF2蛋白包含多個抗原區(qū)，不同抗原區(qū)刺激機體免疫應答反應差異顯著，從而導致利用不同截短的ORF2蛋白為抗原建立的ELISA，相互之間檢測結果符合率低[14-16]。本研究建立的ELISA與北京萬泰商品化試劑盒符合率較高,為91.2%，而與上海酶聯(lián)和南京森貝咖的商品化試劑盒符合率僅為53.3%和51.6%，查閱試劑盒說明書，發(fā)現(xiàn)北京萬泰商品化試劑盒采用的包被抗原為原核表達的病毒樣顆粒，與本研究所用的抗原相似，故符合率較高，其部分差異可能是由于不同基因型所致；而上海酶聯(lián)試劑盒所用抗原為缺失aa 368-392抗原區(qū)的截短ORF2蛋白，南京森貝咖的則同時還缺失了aa 606-660抗原區(qū)。前期研究發(fā)現(xiàn)，上述兩個抗原區(qū)是HEV主要的顯性抗原區(qū)，刺激機體產生抗體時間早、持續(xù)期長[17]。因此，該兩種試劑盒檢測豬血清中HEV抗體可能存在大量假陰性。本研究建立的ELISA方法所用的抗原包含了上述兩個主要顯性抗原區(qū)，從而大大提高了檢測的精確性。

ELISA方法檢測抗體所用的包被抗原，一方面可以采用天然病毒顆?；虿《緛唵挝坏鞍?，另一方面可以采用基因工程技術體外表達的病毒亞單位蛋白。為便于純化，通常將標簽蛋白與目的蛋白進行融合表達，但是由于標簽蛋白的抗原性，易造成假陽性。前期，我們將豬HEV ORF2蛋白C端268個氨基酸與His標簽進行融合表達，結果發(fā)現(xiàn)表達蛋白發(fā)生多聚化，His標簽包裝至多聚體內部，導致純化蛋白純度不高。隨后利用該融合蛋白建立的豬HEV抗體間接ELISA檢測方法，檢測結果假陽性比例高。本研究基于上述問題，重新設計引物構建表達載體，僅表達豬HEV ORF2蛋白268個氨基酸區(qū)域，不帶任何標簽，然后通過蛋白復性和分子篩純化后，獲得了純度非常高的抗原，成功解決了上述問題。已有的血清學調查發(fā)現(xiàn)，豬HEV感染在我國不同地區(qū)的豬群中非常普遍，陽性率在30%～100%[18-21]。本研究利用建立的間接ELISA調查陜西楊凌周邊養(yǎng)豬場豬HEV感染情況發(fā)現(xiàn)，各豬場陽性率為0%～93.75%。由于豬HEV的人畜共感染性，所以，需定期監(jiān)控上述豬場中豬HEV感染情況，及時制定預防措施，減少對人傳播的可能。

4 結 論

利用原核表達純化的基因4型豬HEV衣殼蛋白為包被抗原，通過優(yōu)化ELISA條件，以及與商品化豬HEV抗體檢測試劑盒比較，成功建立豬HEV抗體間接ELISA檢測方法，該方法具有較好的敏感性和特異性，準確率較高，適用于臨床血清樣品豬HEV抗體的檢測和豬HEV感染血清流行病學的調查。