不同來源的3株牛病毒性腹瀉病毒對(duì)小鼠的致病性分析

阮文強(qiáng)，陳新諾，任玉鵬，覃思楠，湯 承,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2. 國家民族事務(wù)委員會(huì)青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，成都 610041)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是引起犢牛腹瀉的重要病原，該病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛存在，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病毒不僅能感染牛，引起犢牛發(fā)生腹瀉等癥狀，還可以感染各種動(dòng)物，如豬、綿羊、山羊和野生有蹄類動(dòng)物[2-3]。根據(jù)BVDV 5′UTR、Npro等基因序列的差異，可將BVDV分為2種基因型，即BVDV1和BVDV2型，從生物角度每個(gè)基因型可分為致細(xì)胞病變和不致細(xì)胞病變型。BVDV感染后可表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為發(fā)燒、腹瀉、持續(xù)性感染、免疫抑制性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、生殖障礙等[4-6]，出血性綜合征則表現(xiàn)為出血、血小板減少和黏膜病等[7-9]。有研究顯示，急性BVDV感染后主要表現(xiàn)為白細(xì)胞減少和血小板減少等癥狀[10-12]。這些血液學(xué)方面的異?？赡軞w因于BVDV的感染和復(fù)制所致[12-13]。BVDV誘導(dǎo)血小板減少癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。然而，有報(bào)道稱是因?yàn)楦腥綛VDV后加速了血小板的破壞速率或減少了血小板的生成速率[14-15]。另外有研究顯示以BALB/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，通過組織病理變化，免疫組化等試驗(yàn)表明肺是BVDV病原的主要復(fù)制器官[16]。

目前，國內(nèi)關(guān)于BVDV感染小鼠的致病性和動(dòng)物模型研究較少，為了探索BVDV感染小鼠后的致病性。本研究利用腹腔注射的方式誘導(dǎo)BVDV感染BALB/c小鼠，并通過病理組織學(xué)、血液學(xué)和熒光定量PCR的方法對(duì)收集到的血液和組織進(jìn)行檢測。探究攻毒之后BVDV在小鼠體內(nèi)的感染情況以及白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞的變化情況，比較BVDV在小鼠血液和組織之間感染的差異，以及BVDV感染小鼠后產(chǎn)生的病理變化和臨床癥狀。為更好地研究BVDV感染動(dòng)物模型的建立和致病性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雌鼠BALB/c(18～22 g)36只購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；本研究攻毒組隨機(jī)分為3組，分別為Z6組、DJ2組和OregonC24V組，另設(shè)1個(gè)對(duì)照組，共4組，每組各9只BALB/c小鼠。

1.2 毒株、儀器及主要試劑

BVDV1-Z6和BVDV1-DJ2分離株由本實(shí)驗(yàn)室分別從牦牛腹瀉糞便和健康牦牛糞便樣本中分離得到，病毒TCID50·100 μL-1分別為10-8.11和10-5.81，兩株分離株均屬于致細(xì)胞病變型；OregonC24V毒株購自中國藥品生物制品檢定所；一次性1 mL無菌注射器；牛腎上皮細(xì)胞(MDBK)；DMEM培養(yǎng)基；熒光定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司；BM860血常規(guī)分析儀購自泰安市泰諾科貿(mào)有限公司；QuickTaqHS DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；DNA Marker Ⅱ購自寶生物工程(大連)有限公司；Prime ScriptTMRT試劑盒購自寶生物工程有限公司；Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)購自上海英駿生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

3株不同來源的BVDV毒株經(jīng)過MDBK細(xì)胞接種繁毒后保存于-80 ℃冰箱備用。將BALB/c小鼠飼養(yǎng)在無菌條件的動(dòng)物房，在小鼠適應(yīng)1 d之后，攻毒組OregonC24V、Z6和DJ2每只小鼠各自腹腔注射6.0×106TCID50病毒液。對(duì)照組每只小鼠各自腹腔注射1 mL DMEM。攻毒完成后每天觀察小鼠的活動(dòng)狀況和精神狀態(tài)并記錄。

1.4 病料采集

攻毒后第5、7和10天每組各處理3只小鼠并采集組織、糞便和血液等樣本，每天定時(shí)稱量小鼠體重。本研究通過眼眶采血的方式收集血液，并用枸櫞酸三鈉作為抗凝劑收集血液用于血常規(guī)檢測(白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞)。在無菌操作臺(tái)上解剖小鼠并觀察其臟器的病理變化，采集每只小鼠腸道、心、肝、脾、肺、腎等組織。對(duì)收集到的組織一部分用于BVDV抗原的檢測，另一部分則用4%的多聚甲醛固定液固定，用于HE染色并觀察其病理變化。

1.5 RNA提取

將糞便樣品和組織樣品反復(fù)研磨，加入1 mL生理鹽水，經(jīng)過反復(fù)凍融后，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清。參照上海英俊生物科技有限公司Trizol試劑盒(RNAisoPlus)說明書提取從小鼠身上采集到的各組織和糞便的RNA，取500 μL上清液加入700 μL的Trizol,室溫靜置10 min；加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩15 s，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min， 取上清液；加入等體積的異丙醇充分顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min， 棄上清液，加入1 mL 75%(經(jīng)DEPC處理過的滅菌水配制)乙醇；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用15 μL經(jīng)過DEPC處理過的無菌水溶解沉淀，置-80 ℃冰箱備用。利用Prime Script TMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 組織熒光定量PCR的檢測

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室已建好的熒光定量PCR方法對(duì)采集的組織和糞便中BVDV的感染率進(jìn)行檢測。引物序列：F-CTCAGCGAAGGCCGAAAA；R-CAGGGCTTCAGCCATCCA，目的片段100 bp。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Ⅱ 10 μL，引物F/R均為10 pmol·L-1各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，61 ℃ 30 s，最后新增一個(gè)溶解段，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.7 血液血常規(guī)的測定及相關(guān)組織HE染色

將加有抗凝劑(枸櫞酸三鈉)的血液使用BM860血常規(guī)分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測，主要包括血小板(PLT)、白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)。另外用4%多聚甲醛固定液固定后的肺、脾、肝、十二指腸、空腸和回腸送到成都市里來生物技術(shù)有限公司制備切片，并進(jìn)行HE染色。對(duì)得到的數(shù)據(jù)和切片進(jìn)行收集、觀察和整理。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 攻毒后小鼠的臨床癥狀以及剖解病理變化

在本研究中，3組攻毒組通過腹腔注射接種BVDV病原后，大部分被感染的小鼠都表現(xiàn)出一定的臨床癥狀。主要表現(xiàn)為聚集成堆、被毛粗糙、采食量減少、精神沉郁、輕微腹瀉等。解剖可見攻毒組小鼠肺和肝有出血點(diǎn)，脾邊緣發(fā)紺并伴有腫大，腸道內(nèi)容物呈黃色水樣狀，Z6組與DJ2組相比，Z6組病理變化更加明顯。整個(gè)試驗(yàn)過程中，對(duì)照組小鼠沒有明顯的臨床癥狀和病理變化。

2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測

采用熒光定量PCR方法對(duì)BVDV在小鼠體內(nèi)的感染情況進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攻毒后第5天，Z6組和DJ2組中空腸、結(jié)腸以及OregonC24V組中肺、十二指腸、結(jié)腸沒有檢測到BVDV，其他組織均能檢測到BVDV；攻毒第7天，Z6組空腸，DJ2組空腸、結(jié)腸以及OregonC24V組肺、空腸、回腸、結(jié)腸沒有檢測到BVDV，其他組織均能檢測到BVDV；攻毒第10天，除Z6組空腸、回腸，DJ2組肝、回腸、結(jié)腸等組織外，其他組織均能檢測到BVDV；OregonC24V組中在肺、肝、脾、十二指腸和空腸中能檢測到BVDV。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，攻毒組小鼠糞便中均能檢測到BVDV，而對(duì)照組小鼠組織和糞便均不能檢測到BVDV。從組織檢測率來看，肺、肝和脾的檢出率高于其他組織，Z6組高于DJ2組，猜測小鼠肺和肝可能是BVDV復(fù)制的主要器官。

2.3 攻毒后小鼠的體重變化

小鼠攻毒后，每天定時(shí)稱量并記錄小鼠體重變化。如圖1所示：可以看出，攻毒后第7天與第5天相比，Z6組小鼠體重顯著降低(P<0.05)；攻毒第7天，DJ2組和OregonC24V組小鼠體重有明顯的降低趨勢，且差異極顯著(P<0.01)，Z6組差異顯著(P<0.05)；攻毒第10天，Z6組和DJ2組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，OregonC24V組差異極顯著(P<0.01)。整個(gè)試驗(yàn)過程中，攻毒組體重增加無明顯變化，而對(duì)照組小鼠體重增加明顯。

表1小鼠組織中BVDV的熒光定量PCR檢測結(jié)果

Table1ThedetectionofBVDVinmicetissuesbyfluorescencequantitativePCR

樣品Sample第5天第7天第10天Z6DJ2OregonC24VZ6DJ2OregonC24VZ6DJ2OregonC24V肺2/31/30/32/32/30/33/31/31/3肝2/31/32/32/31/31/32/30/32/3脾1/31/32/31/32/31/31/31/31/3十二指腸1/33/30/33/31/31/32/31/31/3空腸0/30/32/30/30/30/30/31/31/3回腸1/31/31/31/31/30/30/30/30/3結(jié)腸0/30/30/31/30/30/32/30/30/3糞便3/32/33/33/33/32/33/33/33/3

表格中分?jǐn)?shù)的分母代表檢測的樣本數(shù)量，分子代表BVDV檢測呈陽性的樣本數(shù)量

The denominator of the score in the table represents the number of tissue samples, the numerator represents the number of samples tested positive for BVDV

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)The * indicate significant difference (P<0.05), the ** indicate extremely significant difference (P<0.01)圖1 攻毒組和對(duì)照組小鼠攻毒后體重變化Fig.1 Changes of body weight of mice in the experimental group and the negative control group

2.4 血液血常規(guī)檢測

將加有枸櫞酸三鈉作為抗凝劑的血液使用BM860血常規(guī)分析儀測定小鼠血液中白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)和血小板(PLT)在攻毒后的變化情況。從圖2中可以看出，小鼠經(jīng)腹腔注射BVDV后，OregonC24V組、Z6組和DJ2組的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板均降低且低于小鼠正常值。如圖2中A圖所示：攻毒第5天，Z6組白細(xì)胞低于對(duì)照組且差異顯著(P<0.05)；攻毒第7天，Z6組和OregonC24V組白細(xì)胞顯著低于對(duì)照組且差異極顯著(P<0.01)，DJ2組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；攻毒第10天，Z6組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，OregonC24V組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

如圖2中B圖所示：攻毒第5天，Z6組和DJ2組淋巴細(xì)胞顯著(P<0.05)低于對(duì)照組；攻毒第7天，Z6組和OregonC24V組淋巴細(xì)胞顯著(P<0.05)低于對(duì)照組；攻毒第10天，Z6組淋巴細(xì)胞極顯著(P<0.01)低于對(duì)照組，OregonC24V組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；在整個(gè)試驗(yàn)過程中，Z6組和OregonC24V組淋巴細(xì)胞持續(xù)降低，攻毒第10 天降低到最低。

如圖2中C圖所示：攻毒后DJ2組總體呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，而Z6組在整個(gè)試驗(yàn)過程中持續(xù)降低。攻毒第7天，DJ2組血小板含量低于對(duì)照組，且差異顯著(P<0.05)；Z6組和OregonC24V組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；攻毒第7天，DJ2組和對(duì)照組血小板含量高于第5和第10 天；攻毒第10天，DJ2組血小板與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；而對(duì)照組基本保持不變且在正常范圍內(nèi)。血常規(guī)結(jié)果表明BVDV感染BALB/c小鼠后，能引起小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板降低。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)The * indicate significant difference (P<0.05), the ** indicate extremely significant difference (P<0.01)圖2 攻毒組和對(duì)照組小鼠攻毒后體內(nèi)白細(xì)胞(圖A)、淋巴細(xì)胞(圖B)、血小板變化圖(圖C)Fig.2 The changing of leukocyte (Fig.A), lymphocytes (Fig.B), platelets (Fig.C) in infected mice of the experimental group and the negative control mice

2.5 組織病理學(xué)變化

從組織病理學(xué)觀察，如圖3所示。攻毒第5天，HE染色可觀察到DJ2組十二指腸黏膜下層少量炎性細(xì)胞浸潤(圖3A)，肺出血(圖3D)等病理變化。Z6組小鼠脾紅髓內(nèi)巨噬細(xì)胞增多；攻毒第7天，DJ2組和OregonC24V組肝細(xì)胞內(nèi)可見空泡或顆粒樣物質(zhì)，肺泡內(nèi)大量蛋白樣物質(zhì)沉積、間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(圖3F)，其他病理變化與攻毒第5天類似。Z6組十二指腸可見固有層內(nèi)大量淋巴細(xì)胞聚集(圖3B)，肝細(xì)胞可見空泡樣變形(圖3H)，少量肝細(xì)胞呈灶狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤，肺可見部分肺泡萎縮，肺泡腔塌陷，體積明顯變?。还ザ镜?0天，OregonC24V組肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量空泡狀物質(zhì)，肝出血(圖3I)，十二指腸腸絨毛上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞壞死或脫落(圖3C)，脾內(nèi)淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞增多。而DJ2組中肝細(xì)胞可見少量顆粒狀物質(zhì)，肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量空泡狀物質(zhì)(圖3G)，肝竇內(nèi)可見深染的圓形單核樣細(xì)胞浸潤，脾內(nèi)淋巴細(xì)胞增多，細(xì)胞排列致密，空腸黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、脫落。Z6組肺泡萎縮、血管內(nèi)大量蛋白樣物質(zhì)沉積(圖3E)，脾紅髓區(qū)域內(nèi)巨噬細(xì)胞不同程度增多，空腸和回腸可見上皮及固有層細(xì)胞不同程度的壞死或脫落，壞死區(qū)域細(xì)胞核溶解消失，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染等病理變化。HE染色結(jié)果表明BVDV感染小鼠后可導(dǎo)致組織病理上的變化，且Z6組與DJ2組相比，病理變化更明顯，而對(duì)照組無明顯病理變化。

A. 十二指腸黏膜下層少量炎性細(xì)胞浸潤(↑)，400×；B. 十二指腸固有層內(nèi)大量淋巴細(xì)胞聚集(↑)，400×；C. 十二指腸腸絨毛上皮細(xì)胞(↑)及固有層細(xì)胞(↓)壞死或脫落，100×；D. 肺出血(↓)，400×；E. 肺泡萎縮(↑)、血管內(nèi)大量蛋白樣物質(zhì)沉積(↓)，100×；F. 肺泡內(nèi)大量蛋白樣物質(zhì)沉積(↑)、間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(↓)，400×；G. 肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量空泡狀物質(zhì)(↑)，400×；H. 肝細(xì)胞空泡樣變性，400×；I. 肝出血(↑)，100×A. Duodenal submucosa inflammatory cell infiltration (↑), 400×; B. A large number of lymphocyte aggregates in the duodenal lamina propria (↑)， 400×; C. Duodenal villous epithelial cells (↑) and lamina propria cells (↓) necrosis or shedding, 100×; D. Lung hemorrhage (↓), 400×; E. Alveolar atrophy (↑), intravascular deposition of large amounts of protein-like substances (↓), 100×; F. Large amount of protein-like substance deposition in alveoli (↑), intrastromal neutrophil infiltration (↓), 400×; G. A small amount of vacuoles in the cytoplasm of the liver (↑), 400×; H. Liver cell vacuolar degeneration, 400×; I. Liver hemorrhage (↑), 100×圖3 攻毒小鼠部分主要病理變化(HE染色)Fig.3 Main pathological changes in inoculated mice (HE staining)

3 討 論

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是引起犢牛腹瀉的重要病原，給世界養(yǎng)牛行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[17]。有研究表明用該病毒對(duì)血清學(xué)BVDV抗體陰性犢牛以鼻孔噴霧途徑進(jìn)行接種試驗(yàn)，犢牛出現(xiàn)明顯的白細(xì)胞總數(shù)減少、體溫升高、呼吸困難等癥狀[18]。也有研究通過人工感染BVDV后的妊娠母羊和胚胎以及所生羔羊，除了產(chǎn)生明顯的臨床癥狀外，剖解還可見消化道黏膜彌散性出血、腸系膜淋巴結(jié)腫大等病理變化[19]。有學(xué)者證實(shí)新西蘭兔飲食被BVDV污染的干草，試驗(yàn)第5天兔被成功感染且大多數(shù)器官檢測呈陽性，淋巴器官出現(xiàn)了典型的組織學(xué)變化[20]。相比其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小鼠更為方便，因此本試驗(yàn)以BALB/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，通過腹腔注射病毒的方式感染小鼠，小鼠不僅出現(xiàn)了典型的臨床癥狀，而且還表現(xiàn)出病理組織上的變化。

本研究通過腹腔注射致細(xì)胞病變的BVDV1型毒株感染BALB/c小鼠后出現(xiàn)了精神萎靡、扎堆、被毛粗糙、腹瀉等臨床癥狀。解剖可觀察到肝和肺有出血點(diǎn)，脾邊緣發(fā)紺和腫脹。血常規(guī)檢測結(jié)果表明OregonC24V組、Z6組和DJ2組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板含量都降低。有研究表明低毒力致細(xì)胞病變的BVDV1型毒株能引起小鼠血液中血小板和淋巴細(xì)胞的降低[21-22]，本研究血常規(guī)結(jié)果與該結(jié)果吻合，而對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過程中，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板都明顯高于攻毒組，且在正常范圍內(nèi)。熒光定量PCR方法可以從攻毒組小鼠肺、脾、肝和十二指腸等組織以及糞便中不同程度檢測到BVDV，且肺和肝中BVDV的檢出率明顯高于其他組織，Z6組BVDV檢出率高于DJ2組，據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果推測小鼠肺和肝可能是BVDV病原的主要復(fù)制器官。有學(xué)者通過腹腔注射非致細(xì)胞病變型BVDV1也能在小鼠不同組織中檢測到BVDV病原[23]，該結(jié)果與本研究類似。

為分析小鼠感染BVDV病原后對(duì)組織造成的病理變化，組織HE染色可見肝的靜脈周圍及肝竇內(nèi)見少量炎性細(xì)胞浸潤，腸黏膜出現(xiàn)不同程度的壞死和脫落，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，Z6組和DJ2組與OregonC24V組相比，Z6組病理變化最嚴(yán)重，DJ2組較輕。有研究通過口服致細(xì)胞病變的BVDV1型毒株感染6～8周齡小鼠后不僅出現(xiàn)了典型的臨床癥狀，且注射高劑量組的小鼠出現(xiàn)體重減輕、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞下降[21]，該研究結(jié)果與本研究相符。另外有研究顯示通過腹腔注射BVDV的方式感染小鼠沒有出現(xiàn)任何典型的臨床癥狀，但BVDV病原能夠在試驗(yàn)組的脾中檢測到[24]，這與本研究結(jié)果存在一定的差異，這些差異可能與病毒感染部位以及病毒毒力強(qiáng)弱有關(guān)，也有可能是由于病毒感染途徑和攻毒劑量的不同所導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

以BALB/c小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，腹腔注射3株 致細(xì)胞病變BVDV1型毒株。根據(jù)臨床癥狀的變化、血常規(guī)、HE染色和組織分布等結(jié)果，表明成功誘導(dǎo)BALB/c小鼠感染致細(xì)胞病變型BVDV。該結(jié)果可進(jìn)一步為BVDV病原感染小鼠動(dòng)物模型的建立和致病性的研究提供一定的數(shù)據(jù)參考和指導(dǎo)。