鴨瘟病毒新近分離毒株部分基因變異分析

傅光華，陳翠騰，劉榮昌，盧立志，施少華，江 斌，傅秋玲，程龍飛，沈軍達(dá)，田 勇，萬(wàn)春和，陳紅梅，黃 瑜*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建省禽病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350013； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

鴨瘟病毒(duck plaque virus, DPV)是引起鴨、鵝和天鵝等雁形目鴨科水禽發(fā)生一種稱為鴨瘟的急性、敗血性、高度致死性傳染病病原[1-2]，又被稱為鴨腸炎病毒。DPV為皰疹病毒科α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬鴨甲皰疹病毒1型成員[2-3]，基因組為雙股線性DNA，不同毒株的基因組全長(zhǎng)存在差異，在158～162 kb，包含長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(UL)、內(nèi)部反向重復(fù)序列(IRS)、短獨(dú)特區(qū)(US)及末端反向重復(fù)序列區(qū)(TRS)，包含約78個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)[3-6]，即基因組結(jié)構(gòu)為UL-IRS-US-TRS。

Baudet等于1923年首次報(bào)道鴨瘟在荷蘭發(fā)生。黃引賢[7]于1957年報(bào)道了我國(guó)廣州出現(xiàn)首例鴨瘟病例。DPV可感染不同品種及日齡的鴨，鴨瘟傳播迅速、流行廣泛，發(fā)病急、死亡率高，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。近年來(lái)該病的流行出現(xiàn)了一些新的變化，如低日齡鴨發(fā)病增多，DPV對(duì)鴨的致病力減弱，免疫鴨群仍出現(xiàn)典型的鴨瘟[8-10]或非典型的鴨瘟病例等[11-13]。福建省曾于1998年出現(xiàn)櫻桃谷肉鴨感染鴨瘟的病例，此后至2015年的17年 間均未見(jiàn)發(fā)生鴨瘟的報(bào)道。然而2016年初開(kāi)始，福建省部分地區(qū)肉鴨陸續(xù)出現(xiàn)疑似鴨瘟的病例[10]，2017年該病仍在鴨群中持續(xù)蔓延。本研究采集了2016—2017年福建不同地區(qū)37份臨床疑似感染DPV的病死鴨肝、食道組織，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)、病毒分離以及部分基因的序列分析，以明確近年來(lái)在福建省鴨群中新流行的DPV分子特征，為新流行鴨瘟的快速確切診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的來(lái)源及處理

樣品為2016—2017年自福建不同地區(qū)送檢的疑似感染DPV病例樣品，共計(jì)37份。采集的樣品經(jīng)磨碎后與含抗生素的0.01 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.2)按1∶3的比例制成懸浮液，將上述組織懸浮液凍融3次后，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 臨床樣品的檢測(cè)及病毒分離鑒定

將處理好的臨床樣品離心后取上清，應(yīng)用EasyPure Viral DNA/RNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取病毒DNA。參照Plummer等[14]提供的方法進(jìn)行DPV的PCR檢測(cè)。獲得的陽(yáng)性樣品經(jīng)尿囊腔接種10日齡非免疫鴨胚，棄24 h內(nèi)死亡鴨胚，無(wú)菌收集24～120 h內(nèi)死亡鴨胚和120 h仍未死亡鴨胚尿囊液，收獲的鴨胚尿囊液經(jīng)PCR檢測(cè)為DPV陽(yáng)性的分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DPV部分基因的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取所有DPV陽(yáng)性鴨胚尿囊液中的病毒DNA，應(yīng)用高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技有限公司)擴(kuò)增24株DPV分離株UL區(qū)域的UL56/LORF5(約4 kb)、TK/gH(約4 kb) 基因、UL2/UL1(約0.7 kb)，擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。反應(yīng)液參照高保真酶使用說(shuō)明配制，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；隨后94 ℃ 30 s，50～58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min結(jié)束反應(yīng)，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳為陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物純化回收后送福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1本試驗(yàn)用擴(kuò)增引物

Table1Thesequencesofprimerusedinthisstudy

引物名稱Primer name上游引物序列(5'→3')Up primer sequence下游引物序列(5'→3')Down primer sequence位置aLocationaUL56/LORF5GTCTACCTCCGACGACATGCAGATGTCTCATCAAGACCAACA2 419—4 602LORF5CGTATAGAGGACCACCATCACTAGTTTCTCGCGCCGCTGA4 425—6 311UL23(TK)CTGCTACGCGTCTACAAGGCGCTGAGATGTGGCGGTTCGA77 919—80 213UL22(gH)TAGCGCATACTCGTTCTCCAGGCAATGTGGACGTATATGA80 140—82 004UL2GAACGCTTCCTGAGCATGCACAGCATCCGTTATGCATTCGA115 105—115 889

a. 引物位置參考CV株(GenBank ID: JQ673560)基因組序列

a. Primers locations were according to the genome sequence of CV strain (GenBank ID: JQ673560)

1.4 序列分析

應(yīng)用生物學(xué)軟件Lasergene 7.0 和MEGA 5.1 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、編輯，并進(jìn)行核苷酸變異及同源性分析；再運(yùn)用MEGA5.1軟件中鄰接法Neighbor-Joining(Kimuar2-parameter算法)分析DPV分離株間的進(jìn)化發(fā)育關(guān)系，構(gòu)建病毒遺傳進(jìn)化樹，利用自展法(Bootstrap Method)檢驗(yàn)進(jìn)化樹的可靠性，共進(jìn)行1 000次重復(fù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 DPV的分離與鑒定

參照Plummer等[14]提供的方法從37份臨床樣品中檢測(cè)到24份DPV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為65%，將24份陽(yáng)性樣品接種10日齡非免疫鴨胚后，收集所有鴨胚尿囊液并進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳顯示，24份尿囊液均擴(kuò)增到目的條帶，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，表明所有擴(kuò)增產(chǎn)物均為DPV基因片段。以上結(jié)果表明，24份陽(yáng)性樣品均成功分離到DPV，其中2016年分離到14株，2017年分離到10株(表2)。從表2可發(fā)現(xiàn)，感染鴨的品種包括半番鴨、番鴨及麻鴨，感染鴨日齡從15至320 d均有。對(duì)感染鴨的日齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，半番鴨和番鴨感染DPV的日齡中位值(Me)分別為90和88 d，而麻鴨感染DPV的日齡中位值為287 d(圖1)。

表2臨床樣品分離的DPV毒株信息

Table2TheinformationofDPVstrainsisolatedfromclinicalsamples

毒株名稱Strain name宿主Host日齡/dAge采樣時(shí)間Collected time采樣地點(diǎn)RegionFujian-16-29半番鴨 Mule duck1672016福州Fujian-16-46半番鴨 Mule duck492016閩侯Fujian-16-47半番鴨 Mule duck452016閩侯Fujian-16-87半番鴨 Mule duck752016閩侯Fujian-16-145半番鴨 Mule duck1202016永泰Fujian-16-79番鴨 Muscovy duck152016莆田Fujian-16-140番鴨 Muscovy duck1202016閩侯Fujian-16-141番鴨 Muscovy duck1302016晉安Fujian-16-143番鴨 Muscovy duck1502016閩侯Fujian-16-36麻鴨 Sheldrake duck1852016福州

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

n. DPV病毒陽(yáng)性樣本數(shù)；Me. 感染鴨日齡中位值n. Number of DPV-positive samples；Me. Medium value of DPV-positive-duck age圖1 感染DPV鴨日齡統(tǒng)計(jì)分析Fig. 1 Statistical analysis of the DPV-positive duck age

2.2 分離株UL56/LORF5測(cè)定分析

本研究對(duì)24株DPV分離株的UL56/LORF5區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了2 432—6 262 bp間約3.83 kb的片段(GenBank ID為MH401564～MH401587)，所分離病毒間序列相似性在99.7%以上，與我國(guó)鴨群中分離的DPV強(qiáng)毒株CHv、LH2011、CV(又標(biāo)記為CSC)及CV同源傳代毒株序列相似性極高，核苷酸相似性介于99.5%～99.8%，與疫苗株VAC或弱毒株(C-KCE和K)、其他地區(qū)的強(qiáng)毒分離株，如毒株2085(德國(guó))、Holland(美國(guó))的基因序列相似性在98.9%左右。值得注意的是毒株2085、Holland、Jansen和D11-JW-016(韓國(guó))等4株病毒在基因組核苷酸2 561位后(核苷酸位置參照毒株CV基因組序列，下同)出現(xiàn)了1 167 bp的連續(xù)缺失，毒株Clone-03在2 703位核苷酸后出現(xiàn)了1 929 bp的連續(xù)缺失，疫苗株VAC或弱毒株(C-KCE和K)在2 715位后出現(xiàn)了3 513 bp核苷酸的連續(xù)缺失，本研究分離的24株病毒與我國(guó)的強(qiáng)毒株在該區(qū)域均未出現(xiàn)核苷酸的缺失或插入。

基于該擴(kuò)增片段的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，所有在該區(qū)域未出現(xiàn)基因缺失的毒株形成了2個(gè)不同進(jìn)化分支(圖2)，其中強(qiáng)毒株CHv、LH2011、CV及其傳代毒株構(gòu)成了進(jìn)化分支Group Ⅰ，本研究分離的24株病毒構(gòu)成了一個(gè)大的進(jìn)化分支Group Ⅱ，這些分離株又形成2個(gè)不同的進(jìn)化群，F(xiàn)ujian-16-01QL、Fujian-16-29、Fujian-17-38、Fujian-17-77和Fujian-17-78等5株病毒構(gòu)成了Group Ⅱa進(jìn)化分支，其余19株病毒形成Group Ⅱb進(jìn)化分支(圖2)，各分離毒株20余位點(diǎn)存在核苷酸差異，其中10個(gè) 位點(diǎn)的核苷酸存在群特異性(表3)。

2.3 分離株TK/gH、UL2/UL1測(cè)定分析

2.3.1TK/gH基因 本研究擴(kuò)增獲得了DPV 77 919—82 004 bp區(qū)域TK/gH基因約4.1 kb的片段(GenBank ID為MH401612～MH401635)，所有24株分離病毒與GenBank中登錄的DPV毒株該區(qū)域的核苷酸相似性在99.9%以上，未出現(xiàn)基因的缺失或插入，基于該基因區(qū)域的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與基于UL56/LORF5區(qū)域的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果類似，所分離的24株病毒中，F(xiàn)ujian-16-01QL等5株病毒構(gòu)成一個(gè)進(jìn)化分支，其余的19株病毒構(gòu)成另外一個(gè)進(jìn)化分支(圖3)。24株分離毒株與GenBank已登錄的病毒株該區(qū)域的序列高度保守，但不同毒株在78 577、78 866及79 333 bp 3個(gè)位點(diǎn)的核苷酸存在差異，這3個(gè)位點(diǎn)均處于TK基因中。毒株FJ-16-01QL、FJ-16-29、FJ-17-77和FJ-17-78在78 577位的核苷酸為胞嘧啶(C)，其余20株病毒及GenBank已登錄的毒株均為胸腺嘧啶(T)；毒株FJ-16-36、FJ-16-46、FJ-16-47、FJ-16-98、FJ-16-128A、FJ-16-140、FJ-16-141、FJ-16-145、FJ-17-18、FJ-17-43和FJ-17-82等11株病毒在78 866位 的核苷酸為胸腺嘧啶(T)，其余13株病毒及GenBank已登錄的毒株均為胞嘧啶(C)；Fujian-16-01QL、Fujian-16-29、Fujian-17-38、Fujian-17-77和Fujian-17-78等5株 病毒在79 333位的核苷酸為腺嘌呤(A)，其余19株病毒及GenBank已登錄的毒株均為胞嘧啶(C)。

標(biāo)注黑三角(▲)的毒株為本研究分離毒株；圖中樹結(jié)處的阿拉伯?dāng)?shù)字為Bootstrap檢驗(yàn)置信值(1 000次重復(fù))，低于75的置信值未顯示Virus marked with black triangle (▲) were isolated in this study; Arabia numbers on the tree node represented confidence values from bootstrap test (1 000 replicates), confidence values less than 75 were not shown圖2 基于UL56/LORF5基因的DPV分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DPV based on UL56/LORF5 gene

2.3.2UL2/UL1基因 本研究擴(kuò)增獲得了DPV 115 106—115 889 bp區(qū)域UL2/UL1基因約0.78 kb的片段(GenBank ID為MH401588～MH401611)，所有24株分離病毒該區(qū)域的序列高度保守，與GenBank中登錄的DPV強(qiáng)毒株CV、CHv、2085及2016年廣西分離株Yulin/2016/30D(KX925439.1)和Yulin/2016/60D(KX925440.1)的核苷酸相似性均在99.9%以上，而疫苗株VAC或致弱毒株C-KCE和K從115 223 位后開(kāi)始出現(xiàn)524 bp的連續(xù)缺失，另外與其他毒株相比，疫苗株VAC在115 160、115 165及115 208位后均有一個(gè)腺嘌呤堿基(A)插入。

表3分離株不同進(jìn)化分支間的差異核苷酸

Table3Differentialnucleotidesamongdifferentvirallineages

病毒進(jìn)化群Virus lineage差異核苷酸位置Location of differential nucleotide2 615*3 3493 3703 5254 2014 2364 2984 4314 7455 464Group ⅠT-CTGAAGACGroup ⅡaA-CGATGGATGroup ⅡbTATGAAGTGC

*. 核苷酸位置參考強(qiáng)毒株CV株(GenBank ID：JQ673560)基因組序列

*. Nucleotide locations were according to the reference virulent virus genome sequence of CV strain (GenBank ID: JQ673560)

3 討 論

標(biāo)注黑三角(▲)的毒株為本研究分離毒株Viruses marked with black triangle (▲) were isolated in this study圖3 基于TK/gH基因的DPV分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of DPV based on the TK gene and gH gene

鴨瘟自1957年在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)已有60多年，盡管各地陸續(xù)出現(xiàn)報(bào)道，但各分離毒株的抗原性高度保守，疫苗的使用對(duì)該病的控制取得了顯著效果[2]。然而，近年來(lái)，臨床上病例報(bào)道日漸增多，部分免疫過(guò)鴨瘟疫苗的鴨群依然發(fā)生該病[9-11]，鴨瘟的地方性流行已不容忽視。本研究對(duì)2016—2017年福建省鴨群中流行的鴨瘟病毒流行狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，低日齡鴨發(fā)生鴨瘟的病例日漸增多，且易感日齡存在品種差異。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，確診的24個(gè)病例為肉用番鴨、半番鴨及麻鴨；半番鴨和番鴨感染DPV的日齡中位值(Me)分別為90和88 d，而麻鴨感染DPV的日齡中位值為287 d(圖1)，即半番鴨及番鴨多在青年期較易感染DPV，而麻鴨則在產(chǎn)蛋高峰期更易感染該病毒。鑒于這種品種間的易感日齡差異，建議對(duì)以上不同鴨品種制定針對(duì)性鴨瘟疫苗免疫程序，以免因免疫程序不當(dāng)造成的免疫失敗。對(duì)于24個(gè)發(fā)病鴨群，經(jīng)調(diào)查其中17個(gè)鴨群分別于發(fā)病前不同時(shí)間免疫過(guò)不同羽份量的鴨瘟弱毒疫苗，但依然發(fā)病，且病死率很高，這可能與疫苗運(yùn)輸和保存不當(dāng)、疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定等有關(guān)，為此建議鴨瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)銷單位予以重視。至于新流行鴨瘟病毒是否發(fā)生抗原性變異，尚需進(jìn)一步研究明確。

據(jù)DPV基因組5′末端UL區(qū)域(UL56/LORF5)基因缺失情況，可將現(xiàn)有的DPV大致分為四類，一類是以我國(guó)參考毒株CV株(又稱為CSC株)及CHv株為代表的強(qiáng)毒株，其基因組最長(zhǎng)，在162 kb以上[5-6,15-17]；第二類是以德國(guó)毒株2085為代表的強(qiáng)毒株，其基因組在2 561位(參照毒株CV基因組序列，下同)后出現(xiàn)了1 171 bp的連續(xù)缺失[15,18]，另外登錄在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的美國(guó)Holland分離株、法國(guó)Jansen分離株及韓國(guó)D11-JW-016分離株均在該區(qū)域出現(xiàn)相同片段缺失；第三類是以Clone-03為代表的毒株，其基因組在2 703位 核苷酸后出現(xiàn)了1 930 bp的連續(xù)缺失[19-20]；第四類是以疫苗株VAC為代表，這類病毒基因組全長(zhǎng)158 kb左右，在基因組2 715位后出現(xiàn)了3 513 bp核苷酸的連續(xù)缺失[4,15]，弱毒株C-KCE和K也在該區(qū)域出現(xiàn)相同的基因缺失[21-22]。本研究所分離的24株毒株在基因組變異較大的5′末端UL區(qū)域(UL56/LORF5)均未出現(xiàn)基因連續(xù)缺失。盡管所分離的24株病毒之間及與我國(guó)強(qiáng)毒參考株CV及CHv等毒株間同源性極高，但前者與后者在5′末端UL區(qū)域(UL56/LORF5)存在30多個(gè)核苷酸差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，所有已報(bào)道的在該區(qū)域未出現(xiàn)連續(xù)缺失的毒株演化成了2個(gè)不同進(jìn)化分支(圖2)，本研究分離的24株病毒構(gòu)成了一個(gè)新的進(jìn)化分支(Group Ⅱ)，且這些分離株存在不同程度的差異，在Group Ⅰ、Group Ⅱa和Group Ⅱb 3個(gè)群之間存在10個(gè)進(jìn)化分支特異性的差異性核苷酸位點(diǎn)(表3)。可見(jiàn)，當(dāng)前在鴨群中流行的DPV出現(xiàn)了不同程度的、有規(guī)律的變異，毒株在流行過(guò)程中形成了不同的進(jìn)化亞分支。目前還不清楚這些變異是否會(huì)改變病毒的抗原性，是否與毒株持續(xù)在鴨群、甚至在免疫鴨群中流行相關(guān)。

本研究對(duì)24株病毒的TK基因及gH基因分析表明，盡管該區(qū)域與GenBank中登錄的DPV毒株有極高的序列同源性，但在TK基因中還是存在3位點(diǎn)的差異，且其中2個(gè)位點(diǎn)(78 577 bp及79 333 bp)變異的毒株均為上述Group Ⅱa進(jìn)化分支中的毒株。根據(jù)DPV基因組3′末端UL區(qū)域可將現(xiàn)有的DPV大致可分為兩群病毒，一群是以CV、CHv及2085等強(qiáng)毒株為代表的毒株，在3′末端UL區(qū)域(UL2基因)未出現(xiàn)基因的缺失[6,17,19]，另一群是疫苗株VAC或致弱毒株C-KCE和K等毒株，其基因組在115 223位(參照毒株CV基因組序列)后開(kāi)始出現(xiàn)524 bp的連續(xù)缺失[4,15, 21-22]。本研究所分離的24株DPV與我國(guó)DPV參考強(qiáng)毒CV、CHv及其他流行毒株在該區(qū)域的序列相似性達(dá)到100%，未出現(xiàn)連續(xù)的基因缺失。以上結(jié)果表明，所分離的24株病毒TK、gH及UL2基因區(qū)域在傳播流行過(guò)程中高度保守。

4 結(jié) 論

對(duì)2016—2017年福建省鴨群中發(fā)生的鴨瘟流行狀況及其病毒的分子特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)鴨感染DPV存在品種間的易感日齡差異，當(dāng)前新流行的DPV與我國(guó)參考強(qiáng)毒株的分子特征相近，但在部分基因上已出現(xiàn)不同程度的變異，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)新流行DPV的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，以實(shí)時(shí)了解其變異情況。