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    電針對腦缺血-再灌注損傷大鼠運動功能的改善作用及機制研究*

    2018-10-30 07:56:02王海英亞白柳王文淼劉文彥
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腦缺血電針

    王海英 亞白柳 王文淼 劉文彥△

    (1濟寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2濟寧醫(yī)學(xué)院行為醫(yī)學(xué)重點實驗室,濟寧 272067)

    針刺在中國已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)千年,是中國傳統(tǒng)醫(yī)術(shù)的一種。電針是結(jié)合了現(xiàn)代技術(shù)后的產(chǎn)物,它是指在毫針針刺的基礎(chǔ)上輸入脈沖電流[1],來達(dá)到治病的目的[2]。電針技術(shù)已廣泛應(yīng)用到缺血性腦損傷的臨床治療中。缺血性腦損傷的發(fā)病率高,其死亡率已居于我國疾病死亡原因的前6位[3]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對機體的內(nèi)、外環(huán)境的變化極為敏感,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 ( glucose regulated protein,GRP78)通常被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物,可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的修飾和正確折疊,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能具有保護作用[4];caspase12是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的促凋亡因子,正常狀態(tài)下與GRP78結(jié)合,而過強的刺激可使caspase12激活,啟動凋亡通路[5]。本實驗通過觀察電針對大鼠腦缺血-再灌注不同時間的GRP78和caspase12表達(dá)的變化以及肢體運動功能的修復(fù)情況,探討電針的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及分組

    SPF級SD大鼠,雄性,體重(220±10)g,購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號:SCXK魯20130001)。實驗動物于術(shù)前自由喂食和飲水,飼養(yǎng)溫度(20±2)℃,恒定濕度(50±5)%,12h循環(huán)光照,以維持基礎(chǔ)狀態(tài)。所有動物實驗均遵循國家實驗動物飼養(yǎng)管理條例和使用指南以及濟寧醫(yī)學(xué)院實驗動物管理條例。caspase12 mRNA RT-PCR擴增和GRP78免疫熒光實驗(只有3h、6h、12h和24h組):SD大鼠隨機分為對照組(sham組,5只)、腦缺血-再灌注組(I/R組,30只)和再灌注時間點+電針組(I/R+EA組,30只),I/R組按再灌注時間點分為3h、6h、12h、24h、72h、120h 6個亞組,每組5只,I/R+EA組根據(jù)I/R各亞組時間點對應(yīng)分為6組,每組5只。大鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀實驗:35只SD大鼠隨機分為sham組(5只)、I/R組(15只)和I/R+EA組(15只),I/R組和I/R+EA組根據(jù)時間點7d、14d和30d各分為3個亞組,每組5只。

    1.2 方法

    1.2.1動物模型的制備[6]制備MCAO模型,按照Longaⅴ級評分法于術(shù)后清醒1h后給實驗動物評分,1~3分的動物為模型制備成功。

    1.2.2電針方法[7]大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后,于再灌注開始后30min,對“水溝”和“百會”穴進行電針刺激,持續(xù)30min,最后一次電針結(jié)束后30min取材。

    1.2.3肢體運動功能修復(fù)[8]各組實驗動物于術(shù)后3h統(tǒng)一進行評分,選擇評分4~5級的大鼠為疲勞棒實驗?zāi)P统晒游?,I/R+EA組大鼠每天電針治療1次、30min,連續(xù)電針干預(yù)7d,對再灌注7d、14d和30d組的大鼠進行疲勞轉(zhuǎn)棒儀實驗,40轉(zhuǎn)/min,各組分別于術(shù)前進行訓(xùn)練,選擇能在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上停留2min以上的大鼠,分別于術(shù)后第2天開始,每天訓(xùn)練2次,分別于再灌注7d、14d和30d進行疲勞轉(zhuǎn)棒測試,每只大鼠測5次,記錄大鼠在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間,取平均值,最長停留時間為15min即停止疲勞轉(zhuǎn)棒儀,觀察大鼠肢體運動功能恢復(fù)狀況。

    1.2.4RT-PCR檢測caspase12 mRNA 用DNAstar軟件設(shè)計引物,引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。

    表1 caspase12 mRNA引物序列

    1.2.5GRP78免疫熒光實驗 制備冰凍切片,厚度12 μm,加入GRP78一抗工作液,4℃過夜,加入熒光二抗,PI工作液室溫復(fù)染,激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的陽性反應(yīng)物[8]。FITC是波長為488 nm藍(lán)色激發(fā)光,波長為515 nm的綠色觀測光。每個鼠腦標(biāo)本選取不連續(xù)的4張切片,每張切片計數(shù)4個視野, 取細(xì)胞計數(shù)的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析[9]。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠肢體運動功能指標(biāo)變化

    I/R+EA組(7 d和14 d)大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間與對應(yīng)的I/R組相比顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);I/R+EA組(30 d)大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間與對應(yīng)I/R組相比變化不明顯(P>0.05)。見表2。

    表2 3組大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間(秒,

    2.2 各組大鼠腦組織caspase12 mRNA表達(dá)情況

    與sham組相比,腦缺血-再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h后大鼠腦組織中caspase12在mRNA水平上的表達(dá)顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);電針干預(yù)后caspase12 mRNA的表達(dá)與I/R組相比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

    2.3 大鼠腦組織GRP78的表達(dá)情況

    3h、6h 、12h、24h I/R+EA組大鼠缺血部位腦組織GRP78陽性細(xì)胞數(shù)和對應(yīng)的I/R組比較顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表4。

    表3 3組間caspase12 mRNA的表達(dá)

    注:胞漿內(nèi)GRP78陽性呈綠色,60×,1為sham組; 2、3、4和5為3 h、6 h、12 h和24 hI/R組;6、7、8和9為對應(yīng)時間點I/R+EA組。

    表4 3組間GRP78陽性細(xì)胞數(shù)比較(個/視野,

    3 討論

    腦血管病是臨床上的常見病,其中缺血性腦卒中所占的比例最高,嚴(yán)重危害了人類生命及健康。近幾年,對于缺血性腦卒中的治療及機制方面的研究取得很大的進展[10]。腦缺血區(qū)分為急性缺血中心區(qū)和周圍缺血半暗區(qū)[11],腦缺血損傷側(cè)大腦半暗帶廣泛存在凋亡現(xiàn)象,以缺血損傷側(cè)大腦皮層及紋狀體為甚,神經(jīng)元對缺氧刺激因素比較敏感,可發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞壞死。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,參與機體許多重要生理功能的維持,包括信號肽的識別、糖基化修飾以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等[9,12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常敏感,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列反應(yīng)時,都可以導(dǎo)致ER功能障礙,比如:糖基化抑制、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運異常[13]、二硫鍵形成障礙等,即發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[14]。在許多分子伴侶蛋白的協(xié)助下,蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可以發(fā)生正確折疊,其中,分子伴侶蛋白包括Bip/Grp78(immunoglobulin binding protein78)和Grp94(glucose-regulated protein94)等。Hayashi 等[15]認(rèn)為,GRP78 而非GRP94決定了神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性。此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能促進IRE1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子CHOP基因表達(dá)和caspase12的激活,參與凋亡的過程[16]。

    疲勞轉(zhuǎn)棒儀實驗?zāi)芡ㄟ^對大鼠運動功能的測試,觀察大鼠肢體運動功能修復(fù)狀態(tài),包括大鼠運動協(xié)調(diào)能力和肢體力量,是反應(yīng)神經(jīng)功能的修復(fù)情況的很好的行為學(xué)指標(biāo)。本文結(jié)果顯示,電針干預(yù)可以幫助大鼠修復(fù)肢體的運動功能及肢體協(xié)調(diào)能力,從而促進大鼠神經(jīng)功能恢復(fù);腦缺血-再灌注損傷后腦組織中caspase12在mRNA表達(dá)上調(diào),所對應(yīng)的再灌注時間點,經(jīng)電針干預(yù)后caspase12 mRNA的表達(dá)明顯降低;腦缺血-再灌注損傷后大鼠腦細(xì)胞GRP78表達(dá)明顯升高,電針干預(yù)后GRP78的表達(dá)顯著降低;電針干預(yù)后能下調(diào)缺血側(cè)腦組織中GRP78和caspase12 mRNA的表達(dá)。GRP78和caspase12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白,也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路的關(guān)鍵因子,GRP78的過度表達(dá)能使神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性增強,加速神經(jīng)元的損傷;caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面,能與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子協(xié)同,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;最新的研究顯示,caspase12也能獨立引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此,我們推斷電針促進缺血性腦損傷大鼠肢體運動功能修復(fù)可能與阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)。

    綜上所述,電針干預(yù)能通過降低腦細(xì)胞內(nèi)caspase12 mRNA和GRP78的表達(dá)幫助修復(fù)大鼠肢體的運動功能,發(fā)揮腦保護作用,為探討電針治療缺血性中風(fēng)的作用機制提供了有效的實驗依據(jù)。

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