自噬相關(guān)基因在大鼠腦缺血-再灌注損傷模型中的差異表達(dá)*

白 波 王春梅

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所，濟(jì)寧 272067)

近年來腦卒中嚴(yán)重威脅人類的健康，其中缺血性腦卒中在我國中老年人群中發(fā)病率極高，且呈上升趨勢，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1-2]。腦卒中后，盡早恢復(fù)腦血流是目前救治患者最有效的手段之一，然而血管再通，恢復(fù)血流，反而會加重腦組織的損傷，即腦缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/R)[3-5]。腦缺血-再灌注損傷的病理機(jī)制十分復(fù)雜，其機(jī)制與炎癥的發(fā)生發(fā)展、自由基過度形成、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載及興奮性氨基酸毒性等因素相關(guān)[6-8]。到目前為止，腦缺血-再灌注損傷的具體分子機(jī)制仍尚不明確，亟需深入研究。

自噬(autophagy)是一種在應(yīng)激情況下，機(jī)體所做出的一種防御調(diào)控機(jī)能，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[9]。研究表明，心、腎、腦等缺血-再灌注損傷過程中均有自噬現(xiàn)象的發(fā)生。Matsui等[10]的研究顯示，自噬相關(guān)蛋白在心肌缺血時表達(dá)增多，而在再灌注時期，增多則更為明顯。Wu等[11]研究證實在腎臟缺血-再灌注過程中，短時間的缺血-再灌注可以抑制自噬的發(fā)生，維持腎臟ATP的水平，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力保護(hù)腎臟。國內(nèi)外學(xué)者先后證實了腦缺血-再灌注也可以激活自噬，其中適量自噬對細(xì)胞起到一定保護(hù)作用[12-13]；然而自噬過度激活會對細(xì)胞造成一定的損傷[14-15]。目前自噬在腦缺血-再灌注損傷過程中的確切作用與作用機(jī)制尚不明確。

本文利用RNA-Sequencing篩選自噬相關(guān)基因在大鼠腦缺血-再灌注24h時的表達(dá)，采用RT-PCR動態(tài)檢測自噬相關(guān)基因在缺血2 h及不同再灌注時間點(6、12、24、48h)的表達(dá)變化，以期驗證自噬參與腦缺血-再灌注損傷過程，為進(jìn)一步研究自噬在腦缺血-再灌注損傷中的機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與分組 SPF級雄性Wistar大鼠，體重約180～210g，由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供(許可證號：SCXK(魯)20140007)。大鼠飼養(yǎng)于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所動物房，飼養(yǎng)的環(huán)境溫度維持在22～28℃，濕度50%～60%。實驗操作之前，除實驗需求干預(yù)外，大鼠均自由覓食、飲水，白晝夜均12h更替，保證大鼠的良好生活環(huán)境。動物管理均遵循國家實驗動物飼養(yǎng)管理條例和使用指南以及濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實驗動物管理條例。

雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham,6只)和模型組(30只)。按造模后缺血和再灌注時間點分為缺血2h(I組)和再灌注6h、12h、24h、48h 5個亞組(I/R組)，每組6只。造模后分別取缺血側(cè)皮質(zhì)提取總RNA用于RNA測序、RT-PCR及qRT-PCR基因組測序和差異基因的表達(dá)驗證。

1.1.2主要試劑 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購于美國Sigma公司，TRIzol購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司，F(xiàn)astQuant RT Kit試劑盒和SuperReal PreMix Plus均購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠局灶性腦缺血-灌注損傷模型制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛醉(0.4ml/100g)后，分離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)和頸外動脈(extemal carotid artery,ECA)，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，微動脈夾夾閉頸CCA近心端和ICA遠(yuǎn)心端。在ECA上剪一小口，用自制處理過的釣魚線從頸外動脈剪口處插入，經(jīng)CCA進(jìn)入ICA，以CCA分叉處開始計算，進(jìn)線深度為(18.0±0.5)mm，行至大腦中動脈起始部形成栓塞，造成局灶性腦缺血狀態(tài)。

1.2.2TTC染色 將上述正常組和缺血2h再灌注24h的大鼠處死，取腦組織置于-20℃冰箱30min。隨后自大腦前極處連續(xù)切取大腦冠狀切片，共6張，每張厚度2mm。將切片放置1%的TTC染液中，37℃恒溫箱內(nèi)避光孵育約20min，期間每5min觀察1次，待其染色均勻后吸出TTC染液，PBS沖洗2遍后用4%的多聚甲醛室溫固定。固定24h后相機(jī)拍照，并利用Image J軟件進(jìn)行分析，計算出梗死體積。腦梗死體積=(梗死面積×厚度)/(腦切片總面積×厚度)×100%。

1.2.3RNA測序 Trizol法提取對照組和缺血2h再灌注24h模型組皮層組織總RNA。紫外吸收測定法檢測總RNA的濃度和純度。然后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，在得到的mRNA中加入適量打斷劑使其片斷化，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、3’末端加堿基A、加測序接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成整個文庫制備工作。構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測，文庫質(zhì)控合格后進(jìn)行測序。

1.2.4測序數(shù)據(jù)分析 測序所得的原始數(shù)據(jù)首先進(jìn)行質(zhì)控，以確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。質(zhì)控后，經(jīng)過濾得到的序列比對到參考序列，并進(jìn)行差異基因表達(dá)分析和Pathway顯著性富集分析。

1.2.5qRT-PCR 利用FastQuant RT 試劑盒(TIANGEN)將上述所提總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系及步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。利用SuperReal PreMix Plus (TIANGEN)試劑盒，將上述逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增引物序列見表1)。1)PCR反應(yīng)體系(20μl)：10μl 2×SYBR Premix Ex Taq，0.6μl 10μM正向引物，0.6μl 10μM反向引物，0.4μl 50×ROX，2μl cDNA，6.4μl EDPC水。2)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min；95℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40個循環(huán)。其中β-actin為內(nèi)參對照，反應(yīng)在LightCyclerR 480熒光定量PCR儀中進(jìn)行。采用2-△△Ct相對定量法處理數(shù)據(jù)，通過公式計算獲得靶基因表達(dá)的相對水平。

表1 差異基因的擴(kuò)增引物序列

1.2.6RT-PCR 分別在缺血2h，缺血2h再灌注6h，12h，24h和48h后處死大鼠，取缺血側(cè)皮層組織提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增引物序列見表1)。PCR反應(yīng)體系(20μl)如下：2×PCR Buffer 10μl，10μM上游引物 0.2μl，10μM下游引物 0.2μl，cDNA 1μl，EDPC水 8.6μl。PCR反應(yīng)條件： 94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 50s，72℃ 50s，32個循環(huán)；72℃ 10min，4℃ 保存。β-actin為靶基因的內(nèi)參對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測后，利用凝膠掃描儀觀察結(jié)果并拍像記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同處理組腦梗死體積的變化

TTC染色后，sham組腦組織無梗死，呈均勻紅色。I/R組梗死體積呈白色，較sham組模型增加(30.17±3.21)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明腦缺血-再灌注損傷誘發(fā)腦梗死，該模型制備成功。見圖1。

2.2 自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化

sham組與I/R 24h組間有182個基因表達(dá)存在顯著差異，其中與自噬相關(guān)的差異基因有5個，分別是Calreticulin、ATG3、ATG5、ATG12和ATG13。測序結(jié)果顯示，在缺血-再灌注24h時Calreticulin下調(diào)了0.621，ATG3、ATG5、ATG12和ATG13在缺血-再灌注24h時上調(diào)，分別上調(diào)了0.621，3.078，2.662和1.764，表明自噬相關(guān)基因可能參與了大鼠腦缺血-再灌注損傷。見表2。

表2 自噬相關(guān)基因在sham組與I/R 24h組的表達(dá)

然后通過KEGG Pathway (Qvalue≤0.05)顯著性富集，繪制差異表達(dá)基因參與的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。繪制的自噬信號通路包含4個上調(diào)的自噬相關(guān)基因ATG3、ATG5、ATG12和ATG13，表明自噬信號通路可能參與了大鼠腦缺血-再灌注損傷。見圖2。

2.3 自噬相關(guān)基因在RNA水平上的表達(dá)變化

為了驗證RNA-sequencing結(jié)果，我們進(jìn)一步利用qRT-PCR方法在sham與I/R 24h組間擴(kuò)增上述5個差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因。與sham組相比，在I/R 24h組中，Calreticulin的表達(dá)下調(diào)了0.411，ATG3、ATG5、ATG12和ATG13的表達(dá)分別上調(diào)了0.457，3.534，2.651和1.719， 與RNA-sequencing測序結(jié)果基本吻合。見圖3。

2.4 差異基因在不同時間點的表達(dá)變化

為了分析自噬相關(guān)差異基因在不同缺血-再灌注時間的動態(tài)表達(dá)，我們分別在缺血2h，再灌注6h，12h，24h，48h時取缺血側(cè)皮層組織，進(jìn)行RT-PCR分析。與sham組相比，Calreticulin的表達(dá)在缺血2h時明顯上升，再灌注6 h時其表達(dá)繼續(xù)上升，然后隨再灌注時間的延長其表達(dá)逐漸下降。與sham組相比，ATG3的表達(dá)在缺血2h時上升，再灌注6h時繼續(xù)上升，到再灌注12h時其表達(dá)最高，然后隨再灌注時間的延長，其表達(dá)逐漸下降且穩(wěn)定在一定水平。與sham組相比，ATG5的表達(dá)在缺血2h時顯著升高，再灌注6h和12h時反而降低，然后其表達(dá)逐漸升高，到再灌注24h時最高，且這種高表達(dá)持續(xù)到再灌注48h。ATG12和ATG13的表達(dá)趨勢基本一致，與sham組相比，它們的表達(dá)從缺血2h到再灌注12h持續(xù)上升，然后隨再灌注時間的延長其表達(dá)逐漸下降。見圖4。

注：與sham組相比，*P<0.05

3 討論

證據(jù)表明自噬在腦缺血-再灌注損傷過程中被激活，自噬相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。然而自噬在腦缺血-再灌注損傷中的作用存在爭議。大部分研究結(jié)果支持自噬的激活對腦缺血-再灌注起保護(hù)作用。杜曉薇等[16]研究發(fā)現(xiàn)Atg12在大鼠腦缺血-再灌注6h開始表達(dá)，在24～48h達(dá)到高峰，72h之后逐漸減弱。彭志鋒等[17]研究表明，小鼠腦缺血60min再灌注24h時，Atg5表達(dá)在mRNA和蛋白水平上均顯著升高。而Atg5 siRNA處理使缺血-再灌后的腦梗死體積和水腫率明顯增加，表明 Atg5在小鼠腦缺血-再灌性損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用。自噬抑制劑3-甲基嘌呤(3-MA)能下調(diào)腦缺血-再灌注損傷后神經(jīng)元中Beclin 1表達(dá)，加重細(xì)胞壞死，而自噬激活劑雷帕霉素則上調(diào)Beclin1表達(dá)，減輕大腦損傷[18]。缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)細(xì)胞模型[19]也證明在OGD情況下自噬活動明顯增強(qiáng)，在恢復(fù)正常氧濃度及糖含量后一定時間內(nèi)自噬活動仍持續(xù)增強(qiáng)并保持在較高水平。

然而，有研究認(rèn)為自噬激活是腦缺血-再灌注損傷機(jī)制之一。Buckley等[20]采用大腦中動脈模型制備大鼠局灶性腦缺血模型，并采用氯喹來阻斷自噬，發(fā)現(xiàn)自噬阻斷后大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀得到明顯改善，并且梗死區(qū)面積減少約30%。Zheng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Beclin 1 siRNA能抑制自噬并減輕大鼠大腦缺血-再灌注損傷。Park等[22]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞缺血預(yù)處理明顯上調(diào)LC3II表達(dá)、增加溶酶體活性及自噬空泡數(shù)目，而3-MA明顯抑制缺血預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究利用RNA-sequencing分析了大鼠腦缺血-再灌注損傷模型與對照間差異表達(dá)基因，與自噬相關(guān)的5個基因，Calreticulin、ATG3、ATG5、ATG12和ATG13差異表達(dá)。隨后進(jìn)一步檢測5個差異基因在缺血-再灌注不同時間點的動態(tài)變化，其表達(dá)趨勢基本一致，與缺血組相比，表達(dá)先升高，然后隨再灌注時間的延長其表達(dá)逐漸下降，但表達(dá)動態(tài)表達(dá)的時間點不盡相同。當(dāng)腦組織缺血-再灌注時，自噬相關(guān)基因的表達(dá)逐漸被升高，提示自噬水平逐漸增高，Atg12激活后先后與Atg5、 Atg3、Atg7等結(jié)合被修飾加工后形成自噬體，再與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體。自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平逐漸降低，可能是由于蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過度消耗引起自噬體形成減少所致，但仍需進(jìn)一步驗證。

本文結(jié)果表明自噬相關(guān)基因參與了腦缺血-再灌注損傷，而且也揭示了自噬在腦缺血-再灌注損傷過程中的復(fù)雜性，為進(jìn)一步闡述自噬在腦缺血-再灌注損傷中的作用提供了理論基礎(chǔ)。本研究雖然證實了缺血-再灌注后自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化趨勢，但是其機(jī)制并不是十分明確，尚有待于更進(jìn)一步研究，這也是今后我們研究的一個重點。