補腎健骨湯干預PMOP小鼠BMSCs成骨分化機制的實驗研究

★ 曹奇圣 劉翔 王力

(1.江西中醫(yī)藥大學2016級碩士研究生 南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006)

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis,PMOP)是原發(fā)性骨質疏松癥中最主要的一種類型，約占90%以上，它是由于絕經后的婦女卵巢功能逐漸衰退引起體內雌激素分泌水平降低，導致全身性骨量降低、骨脆性升高、極易造成骨折的一種代謝性疾病[1-2]。根據(jù)我國有關調查顯示：在所有的骨質疏松患者中,在50歲以上人群中，女性患病率約占20.7%,男性約占14.4%;而在60歲以上人群中,患病率則大大升高,尤其在女性當中表現(xiàn)得最為突出[3-5]。因此,降低骨質疏松性骨折,減少因骨質疏松造成的致殘率和死亡率,是醫(yī)學界一項亟待解決的難題之一[6]。PMOP患者的癥狀在早期并不顯著,因而它被稱作是一種“寂靜的疾病”“靜悄悄的流行病”[7]，然在中晚期其主要表現(xiàn)為腰背部疼痛或全身骨骼疼痛,脊柱畸形,脆性骨折等等。本文旨在從具有成骨作用的骨髓間充質干細胞著手，為探究如何治療絕經后骨質疏松癥提供一種切實可行的治療方法。

1 材料

1.1 藥物 補腎健骨湯湯劑，由鹿角霜10g、骨碎補15g、川牛膝15g、鹽杜仲10g、炒菟絲子20g、枸杞子15g、五加皮10g、云苓15g、炒白術10g、炙黃芪30g、炙甘草6g等藥物組成，原材料均來自于江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，由本院制劑室真空包裝成湯劑，每袋30mL。

1.2 動物 30只3月齡SD雌性小鼠，體重(276.13±19.75)g。SD雌性小鼠從中科院動物實驗中心上海購買，動物合格證編碼:SCXX(滬)2013-0005。

1.3 試劑和儀器 胎牛血清(美國Gibco公司);磷酸鹽緩沖液(新西蘭Hyclone公司);α-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胰蛋白酶(新西蘭Hyclone公司);超凈工作臺SW-CJ-1型(蘇凈集團安泰公司);地塞米松(美國Sigma公司);β-磷酸甘油(美國Biosharp公司);ALP檢驗試劑盒(南京建成公司);茜素紅(美國Sigma公司)。

1.4 實驗細胞 去除卵巢后SD雌性小鼠的BMSCs。

2 方法

2.1 PMOP小鼠模型建立 將30只SD雌性小鼠在江西中醫(yī)藥大學動物中心飼養(yǎng)一周后，隨機分為三組：假手術組10只、去卵巢組20只(補腎健骨湯組和生理鹽水組各10只)。假手術組：單純切除雙側卵巢旁邊的脂肪后縫合。去卵巢組去卵巢方法：卵巢切除小鼠經腹腔注射2%戊巴比妥麻醉(給藥濃度為40mg/kg)，固定備皮，常規(guī)碘伏消毒，從背部中下部肋緣下1cm與脊柱旁開1cm交界處行0.5cm縱形切口，結扎輸卵管和血管，將卵巢完整地切除，然后逐層縫合切口。手術后一周，開始給予藥物(給藥劑量為20mL/次)干預，2次/天，持續(xù)15天后通過堿性磷酸酶染色和茜素紅染色來檢測三組小鼠BMSCs成骨分化程度。

2.2 BMSCs培養(yǎng) 將假手術組、補腎健骨湯組和生理鹽水組的30只小鼠，以2%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉注射，用碘伏消毒，在嚴格無菌操作下取出雙側股骨，用無菌剪刀剪斷雙側股骨，再用注射器抽取含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基從骨斷端沖出骨髓，制成密度為1×105cells/cm2的單細胞懸液(地塞米松10μmol/L、維生素C50μmol/L、β-磷酸甘油10μmol/L、10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液)接種在25cm2培養(yǎng)瓶上，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細胞密度均勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，48h后換液，時隔三天換一次，待10天后細胞克隆逐漸融合鋪滿培養(yǎng)瓶底后丟棄培養(yǎng)液，用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗三次，以1.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

2.3 成骨分化能力比較 將獲取假手術組、補腎健骨湯組和生理鹽水組三組的BMSCs逐一進行堿性磷酸酶染色檢測和茜素紅染色檢測，檢測完成后分別記錄各自的成骨分化能力。

3 結果與分析

3.1 15天后三組堿性磷酸酶染色定量檢測比較 堿性磷酸酶(ALP)是骨形成中一種非常重要的酶，幾乎存在于人體各種組織當中，它可以生成磷酸根離子，并與Ca2+相互結合形成磷酸鈣，使骨骼中的鈣得到沉積。本實驗小鼠堿性磷酸酶染色定量檢測顯示：補腎健骨湯組ALP的定量檢測明顯高于假手術組和生理鹽水組，P<0.05。見表1。結果說明,補腎健骨湯能起到促進小鼠股骨中BMSCs成骨分化的作用。

表1 15天后三組堿性磷酸酶染色定量檢測結果金氏單位/gprot

注：三組ALP結果比較，*P<0.05。

3.2 15天后三組茜素紅染色檢測比較結果 見圖1。從圖可以看出，補腎健骨湯組的茜素紅染色后鈣化結節(jié)數(shù)量和面積明顯大于生理鹽水組和假手術組。說明補腎健骨湯能夠促進BMSCs的成骨分化，從而達到治療PMOP的目的。

4 討論

4.1 PMOP與BMSCs成骨分化 PMOP的主要發(fā)病機制是骨吸收大于骨形成，因此，促進骨形成是治療PMOP的一種重要方法，由于BMSCs是成骨細胞的主要來源細胞之一，骨形成的一個先決條件是成骨細胞能否順利從BMSCs分化成熟[8]。PMOP骨形成功能障礙與BMSCs成骨分化過程中成骨轉錄因子的功能變化息息相關，因此，尋找一種能夠促進BMSCs成骨分化過程中成骨轉錄因子來治療PMOP，成為治療PMOP亟待解決的一項任務。

假手術組 生理鹽水組 補腎健骨湯組

圖1 15天后三組茜素紅檢測結果

4.2 補腎健骨湯與BMSCs 本實驗研究顯示：補腎健骨湯組堿性磷酸酶檢測和茜素紅染色檢測的水平明顯高于生理鹽水組，且差異顯著，這就說明了補腎健骨湯對BMSCs的增值具有促進作用，同時能夠促進成骨細胞分化，從而達到預防和治療PMOP的目的。補腎健骨湯對BMSCs的促進作用主要歸因于其藥物組成成分上，方中以鹿角霜、骨碎補、川牛膝為君，補肝腎，強筋骨；以鹽杜仲、炒菟絲子、枸杞子、五加皮為臣藥，滋補肝腎，滋陰養(yǎng)血；云苓、炒白術、炙黃芪為佐藥，補脾益氣，使氣血生化有源，使以炙甘草，調和諸藥，且能補益脾氣。補腎健骨湯具有滋補肝腎，健脾益氣的功效，恰好切中PMOP的病因病機，用補腎健骨湯作為干預藥物來探究其對BMSCs的成骨分化，促進骨形成，從而達到預防和治療PMOP的目的。

4.3 補腎健骨湯與PMOP 中醫(yī)古籍中雖未見PMOP之名,但有許多類似于PMOP的記載,比如“骨痿”“骨痹”“骨枯”等[9]。骨髓增加依賴于腎精的充足,骨得髓養(yǎng)則強勁有力[10]。同時，骨骼的生長、發(fā)育還受到后天脾胃功能的影響，倘脾氣虧虛，后天氣血生化乏源，則骨髓空虛而四肢痿廢。絕經期婦女脾氣虧虛，血液生化無源，無以填充骨髓，則骨枯髓減。因此，對于絕經后骨質疏松癥的治療，其原則應當以滋養(yǎng)腎精和補益脾氣并重，補腎以滋先天之源，健脾而培后天之本[11]。從補腎健骨湯的藥物組成來看，大都是補腎健脾之品，從補腎健脾入手治療絕經后骨質疏松癥符合絕經后婦女的生理特點，本實驗研究已證實，補腎健骨湯中的藥物成分對BMSCs的增值和分化具有推動作用，它能夠促進骨骼的修復和生成，對治療絕經后骨質疏松癥具有良好的臨床療效。