小腦鋅指結(jié)構(gòu)5在結(jié)腸癌中的蛋白表達(dá)及預(yù)后評(píng)估價(jià)值

陸峰，劉成宸，陳威鵬，顏勛，韓瑋

（1.濱?？h人民醫(yī)院普外科，江蘇鹽城224000；2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院普外科，江蘇昆山215300）

雖然目前手術(shù)根治已成為結(jié)腸癌的主要治療手段，但術(shù)后患者5年生存率并不滿意。因此，探索可靠的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)結(jié)腸癌患者手術(shù)根治后進(jìn)行隨訪和評(píng)估有著積極的作用［1］。小腦鋅指結(jié)構(gòu)5（zinc finger protein of the cerebellum 5，ZIC5）是 ZIC家族的重要成員，其表達(dá)的ZIC5蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為68.4 kDa，主要在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮作用［2］。最近，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，ZIC5基因在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮著癌基因的作用［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及ZIC5蛋白對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集從2010年1月至2012年12月于濱?？h人民醫(yī)院普外科行結(jié)腸癌根治術(shù)的76例患者切除的組織標(biāo)本。所有術(shù)后病理組織均由兩名高年資病理學(xué)醫(yī)師確認(rèn)診斷，且每例組織均包含癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織。所有病例均包含完整臨床病理資料及預(yù)后資料，所有患者術(shù)前均未接受任何放化療處理。其中，男34例，女42例，平均年齡為（54.8±14.8）歲，隨訪時(shí)間為3～60個(gè)月。

1.2 主要試劑

兔抗人ZIC5蛋白多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 切片制作及免疫組織化學(xué)法

選取每例組織經(jīng)病理學(xué)確診的特征性部位，固定、洗滌、脫水及透明后，浸蠟和包埋組織，用于長(zhǎng)期保存。采用5μm厚度切片機(jī)對(duì)石蠟組織進(jìn)行切片。以ZIC5蛋白抗體為一抗工作液，稀釋比例為1∶100，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)：①60℃烤箱脫蠟及水化；②高溫修復(fù)切片抗原；③試劑液A（內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷緩沖）和B（正常山羊血清）封閉后，孵育一抗，4℃過(guò)夜；④PBS洗凈后孵育二抗（試劑液C，山羊抗兔／小鼠IgG抗體）及試劑液D（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鏈菌素）；⑤ DAB顯色；⑥ 蘇木素復(fù)染；⑦脫水透明及封片烘干；⑧鏡下觀察，拍照記錄。應(yīng)用免疫組化評(píng)分法（immunoreactive score，IRS）評(píng)估染色結(jié)果。按染色強(qiáng)度記分：未染、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別對(duì)應(yīng)0、1、2、3分；按陽(yáng)性細(xì)胞占比記分：1%～10%計(jì)1分，11%～20%計(jì)2分，21%～30%計(jì)3分，依此類(lèi)推，91%～100%計(jì)10分；IRS＝染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞占比分?jǐn)?shù)，以10分為截?cái)嘀?，IRS＞10為陽(yáng)性。另外，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 20.0軟件和Graphpad 6.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用成組配對(duì)t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析5年總體生存期及無(wú)病生存期，并利用Log-Rank檢驗(yàn)及Cox回歸模型進(jìn)行預(yù)后分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織中主要分布在癌細(xì)胞核，陽(yáng)性表達(dá)率為 71.05%（54／76），平均相對(duì)表達(dá)量為16.44±8.02；在癌旁組織中ZIC5蛋白亦分布在細(xì)胞核（圖 1），陽(yáng)性表達(dá)率為 23.68%（18／76），平均相對(duì)表達(dá)量為6.63±5.14。ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織平均表達(dá)量顯著高于癌旁組織（t＝8.076，P＜0.01）。

圖1 ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（免疫組化法×200）

2.2 ZIC5蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在76例結(jié)腸癌患者中，ZIC5蛋白表達(dá)陽(yáng)性與患者高齡（P＝0.005）、癌組織低分化（P＜0.01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.009）以及 Dukes C期（P＝0.015）密切相關(guān)，而與患者性別、結(jié)腸癌體積無(wú)明顯相關(guān)（均 P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 ZIC5表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響

76例結(jié)腸癌患者Kaplan-Meier法分析結(jié)果見(jiàn)圖2。22例ZIC5表達(dá)陰性患者5年總體生存期平均為（44.32±4.61）月，54例 ZIC5表達(dá)陽(yáng)性患者為（25.11±2.79）月。ZIC5陰性患者5年總體生存期明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性病例（P＜0.01）；ZIC5陰性患者平均無(wú)病生存期為（41.86±4.93）月，ZIC5陽(yáng)性患者為（21.28±2.68）月，ZIC5陰性患者無(wú)病生存期亦明顯高于陽(yáng)性病例（P＝0.001）。見(jiàn)圖2。

表1 ZIC5蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖2 ZIC5蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者5年生存期影響的Kap lan-M eier分析

Cox回歸分析顯示，ZIC5蛋白表達(dá)水平（總體生存期：HR＝2.34，95%CI 1.22～4.46，P＝0.010；無(wú)病生存期：HR＝1.91，95%CI 1.31～2.79，P＜0.01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（總體生存期：HR＝2.73，95%CI 1.43～5.22，P＝0.002；無(wú)病生存期：HR＝2.34，95%CI 1.54～3.54，P＜0.01）及 Dukes分期（總生存期：HR＝3.15，95%CI 1.36～7.32，P＝0.008；無(wú)病生存期：HR＝3.48，95%CI 2.29～5.29，P＜0.01）是結(jié)腸癌患者重要的預(yù)后影響因素。

3 討論

目前，臨床上應(yīng)用癌胚抗原、CA125、p16等指標(biāo)對(duì)結(jié)腸癌患者手術(shù)根治后進(jìn)行隨訪和評(píng)估，已獲得很大收益［4-6］。然而，仍然有許多結(jié)腸癌復(fù)發(fā)病例術(shù)后血清學(xué)未能檢測(cè)出這類(lèi)基因異常表達(dá)，從而未能重視術(shù)后及時(shí)復(fù)查，導(dǎo)致術(shù)后死亡率仍然較高。因此，需要挖掘新型的潛在癌相關(guān)基因，以評(píng)估術(shù)后預(yù)后［7-9］。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示ZIC5蛋白表達(dá)與患者年齡、結(jié)腸癌組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Dukes分期呈正相關(guān)，高表達(dá)者預(yù)后不佳。

ZIC5基因表達(dá)的ZIC5蛋白具有能與特定DNA結(jié)合序列（5′-TGGGTGGTC-3′）特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，而ZIC5蛋白的這個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用相當(dāng)于GLI蛋白，主要在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮作用［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，ZIC5在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且沉默肺癌H1299和H1703細(xì)胞株ZIC5后，癌細(xì)胞的增殖及侵襲力顯著降低，癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G2期［10］。本研究同樣顯示，ZIC5蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，且主要表達(dá)于細(xì)胞核。不僅如此，ZIC5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者高齡、結(jié)腸癌低分化水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes C期相關(guān)，并且其陽(yáng)性預(yù)示著腸癌患者術(shù)后5年總體生存期和無(wú)病生存期明顯下降，提示對(duì)于這類(lèi)患者，更需要加強(qiáng)術(shù)后腸癌復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的。目前，對(duì)ZIC5基因作用機(jī)制的相關(guān)研究已顯示，沉默ZIC5基因后的瘤體內(nèi)CCNB1基因表達(dá)明顯上調(diào)，而Ki67基因表達(dá)顯著下降［10］；ZIC5基因有可能通過(guò)血小板源性生長(zhǎng)因子D介導(dǎo)的FAK和STAT3基因的活化促進(jìn)黑色素瘤的侵襲與浸潤(rùn)，這使之有可能成為化療藥物的靶點(diǎn)［11］。然而，國(guó)內(nèi)有研究顯示胃癌組織中ZIC5基因的表達(dá)水平與癌旁正常組織無(wú)明顯差異，因此對(duì)預(yù)后評(píng)估意義不大［12］。在胃癌中的這一發(fā)現(xiàn)與本研究的主要結(jié)果并不一致，因此，還需開(kāi)展進(jìn)一步的預(yù)后調(diào)查，ZIC5的作用分子機(jī)制也需要深入研究。

綜上，ZIC5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者高齡、結(jié)腸癌低分化水平、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes C期密切相關(guān)，并且其陽(yáng)性預(yù)示著結(jié)腸癌患者術(shù)后預(yù)后不佳。